基于cyt b 基因的黃河上游高原鰍復合體的物種鑒定

伊日貴，高強，劉丹，聶苗苗，晁燕，張存芳，祁得林*，朱世海

（1.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧 810016；2.青海大學生態環境工程學院，西寧 810016；3.青海大學農牧學院動物科學系，西寧 810016）

高原鰍屬Triplophysa隸屬于鯉形目Cypriniformes 條鰍科Nemacheilidae，廣泛分布于青藏高原及其毗鄰地區，是適應青藏高原寒冷、缺氧等氣候特征的特殊類群（朱松泉，1989；武云飛，吳翠珍，1992；Prokofiev，2001）。約有150 種有效種被描述，有證據表明高原鰍屬具有豐富的物種多樣性，許多物種尚未被識別或描述（何春林等，2011）。

黃河上游高原鰍復合體是指由同域分布的、幼魚階段無法從形態特征分辨的高原鰍屬魚類組成。資料表明，黃河上游干流及支流湟水河流域主要分布有擬硬刺高原鰍T.pseudoscleroptera、硬刺高原鰍T.scleroptera、東方高原鰍T.orientalis、隆頭高原鰍T.alticeps、斯氏高原鰍T.stoliczkae、粗壯高原鰍T.robusta、擬鯰高原鰍T.siluroides和黃河高原鰍T.pappenheimi等（武云飛，吳翠珍，1992）。在黃河上游高原鰍復合體中，硬刺高原鰍成體因背部和體側上部具有黑褐色細斑紋，擬鯰高原鰍成體因頭部和軀干寬闊而扁平，粗壯高原鰍因前軀呈圓筒形、背部在背鰭前后各有4～5 塊深褐色斑塊，隆頭高原鰍成體因頭背部高隆等典型特征而易于鑒定和區分，但其他高原鰍因形態特征不具典型性或因表型可塑性（或趨同進化），難以鑒定和區分（何春林等，2011）。更重要的是，在野外資源調查和物種多樣性調研時，往往會采集到大量幼魚，這些正值發育階段的魚類因不具典型特征而無法從形態進行分類和分析，為物種多樣性和資源量的客觀評估帶來了一定的困難。

mtDNA 是研究分子系統學、生物地理學和親緣物種遺傳多樣性的理想分子標記。在mtDNA 的13 個蛋白編碼基因中，cyt b的結構和功能較清楚，且能用通用引物快速擴增，在不同科、屬、種的研究中表現出明顯的遺傳差異（Guoet al.，2005），因此被廣泛用于高原魚類物種鑒定、分子進化、系統地理學和遺傳結構研究（何德奎等，2006；Qiet al.，2007，2015；馮晨光，2018；Fenget al.，2019）。截止目前，針對黃河上游干流及支流湟水河流域高原鰍DNA 條形碼和分子鑒定等方面的研究仍然滯后。本研究通過黃河上游干流及支流湟水河流域高原鰍樣本的采集，利用cyt b基因標記開展分子鑒定，以期為黃河上游干流及支流湟水河流域的高原鰍物種分類、組成研究提供科學依據，為該地區高原鰍物種多樣性的保護奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

高原鰍樣本共95尾，采集于黃河上游干流及支流湟水河流域（表1）。野外采樣時，取肌肉（成體）或幼體整體75%無水乙醇固定后，-80 ℃保存。

表1 樣本采集信息Table 1 Sampling information of Triplophysa complex

1.2 分子生物學鑒定及系統發育分析

1.2.1 DNA 提取 取樣本肌肉組織約30 mg，將組織剪碎后用ddH2O 處理為細胞懸液（處理2 次），按照動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）操作說明提取樣本基因組總DNA，使用NanoDrop 2000 超微量分光光度計進行DNA濃度和純度檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，-20 ℃保存。

1.2.2cyt b基因片段擴增及測序 采用PCR 和通用引物L14724（5’-GACTTGAAAAACCACCGTT G-3’）和H15915（5’-CTCCGATCTCCGGATTACAA GAC-3’）（Xiaoet al.，2001）對mtDNAcytb基因全序列進行擴增。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用20 μL 的PCR 擴增反應體系：1 μL 基因組總DNA，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix Ⅱ，Primer F/R 各1 μL（10 mmol·L-1），加ddH2O 至總體積20 μL；PCR 反應程序為：94 ℃4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將合格的PCR 產物送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序。

1.2.3 數據分析 采用Clustal X（Larkinet al.，2007）和DNA STAR（Burland，2000）的Editseq 比對序列。采用DnaSP6（Rozaset al.，2003）分析單倍型數、單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數、平均核苷酸差異數，并計算序列保守位點、變異位點和簡約信息位點。采用MEGA 11（Tamuraet al.，2021）統計基因序列堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉換、顛換頻率和轉換顛換比。利用BLAST 在NCBI 對單倍型進行同源比對，并下載相似度高的序列：擬硬刺高原鰍（KX373844.1、MG697585.1）、硬刺高原鰍（KX373840.1）、麻爾柯河高原鰍T.markehenensis（MG725416.1）、東方高原鰍（MG725414.1）、隆頭高原鰍（KX373837.1）、斯氏高原鰍（MG725382.1）、粗壯高原鰍（MG697581.1）、擬鯰高原鰍（MG697471.1、MG697474.1）和黃河高原鰍（MG697453.1）。利用PhyloSuite（Zhanget al.，2020）、IQtree v1.6.12（Nguyenet al.，2015）和MEGA 11 分別基于貝葉斯（BI）法、最大似然（ML）法和鄰接（NJ）法構建系統進化樹，以葉爾羌高原鰍T.yarkandensis（GenBank 登錄號：KX373836.1、KT224367.1）為外群。構建BI 樹時，4 條馬爾科夫鏈同時運行1×106代，通過后驗概率評估每個節點，每100代對系統樹抽樣；構建ML 樹時，利用ModelFinder 選擇最佳核苷酸替換模型（GTR+F+I），并采用啟發式搜索算法；NJ 樹采用K2P 雙參數模型，重復取樣次數為1 000。將所有單倍型提交到ABGD 網站（https：//bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html），選擇K2P 模型，P 設為0.001～0.01，X 設為1.5，其余參數設置為默認值。最后利用MEGA 11 計算基于K2P雙參數模型的遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 cyt b基因的堿基組成及序列變異分析

95 尾個體均獲得cyt b基因序列全長，長度為1 140 bp，所測cytb基因序列中未發現堿基的插入或缺失。經檢測，95 條cyt b基因序列隸屬于46 個單倍型，所有序列均已提交至GenBank 數據庫（登錄號：OP616066～OP616111）。在46個單倍型的1 140 個位點中共存在317 個變異位點，約占27.8%。其中，單一突變位點50 個、簡約信息位點267個（23.4%）。單倍型多樣性為0.958，核苷酸多樣性為0.092。cytb基因序列的A、T、G 和C堿基平均含量分別為25.9%、30.9%、16.5%和26.6%，其中A+T 含量56.8%，明顯高于G+C 含量（43.1%），G 含量最低，表現出明顯的反G 偏倚性，與其他硬骨魚類cyt b基因堿基組成的基本特征一致（祁得林等，2009）；且cyt b基因第一密碼子的GC 平均含量為50.0%，第二和第三密碼子的平均含量分別為38.6%和39.8%；轉換位點和顛換位點總數分別為86 個和19 個，堿基變異均勻的分布于該序列的各個區域，但有明顯的密碼子偏倚，第3 密碼子的轉換和顛換位點最多，分別為73 個和17 個，堿基轉換與顛換的比值為4.2，轉換明顯多于顛換。

2.2 高原鰍復合體的分子鑒定

2.2.1 基于BLAST 比對的物種鑒定 46 個單倍型與GenBank 數據庫中的參考序列具有較高相似度（97.63%～100.00%），涉及高原鰍屬魚類9 個物種。15 個單倍型（H32～46）與擬硬刺高原鰍、硬刺高原鰍、麻爾柯河高原鰍3 個物種序列高度相似；8個單倍型（H23～29、31）與東方高原鰍序列高度相似；5個單倍型（H10～14）與隆頭高原鰍序列高度相似；7 個單倍型（H3～9）與斯氏高原鰍序列高度相似；1個單倍型（H30）與粗壯高原鰍序列高度相似；10 個單倍型（H1～2、H15～22）與擬鯰高原鰍、黃河高原鰍序列高度相似（表2）。

表2 高原鰍復合體cyt b基因的采樣編號、單倍型及BLAST比對結果Table 2 Sample number，haplotype and BLAST results of cyt b gene of Triplophysa complex

2.2.2 基于cytb基因的系統進化樹的物種鑒定以葉爾羌高原鰍的2條序列為外群，結合本研究所有單倍型序列，采用BI、ML 和NJ 法構建系統發育樹，3 種系統發育分析方法得到拓撲結構高度一致的系統發育樹（圖1）。待鑒別的所有樣本單倍型序列與其近緣種共聚為8 個明顯的獨立單系群（A～H），但個別聚類支如A 支和H 支的支持率不高。其中，高原鰍復合體的11 個單倍型（H36～46）與擬硬刺高原鰍和麻爾柯河高原鰍的已知序列聚為一個單系群A，4 個單倍型（H32～35）與硬刺高原鰍的序列聚為一支B，8個單倍型（H23～29、H31）與東方高原鰍已知序列組成為單系群C，5 個單倍型（H10～14）與隆頭高原鰍已知序列聚為單系群D，7 個單倍型（H3～9）與斯氏高原鰍已知序列聚為單系群E，1 個單倍型（H30）與粗壯高原鰍已知序列聚為1 個單系群F，3 個單倍型（H2、H21～22）與黃河高原鰍已知序列形成1 個單系群G，其余7 個單倍型（H1、H15～H20）與擬鯰高原鰍2 條已知序列表現出高度的序列同源性，聚在同一支上（H）。

圖1 利用鄰接法構建的高原鰍復合體cyt b序列的系統發育樹Fig.1 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on mitochondrial cyt b sequence for Triplophysa complex

2.2.3 ABGD 劃分 利用ABGD 網站對高原鰍復合體的46 個單倍型序列和GenBank 數據庫下載的已知同源序列進行進一步的劃分檢驗，結果包括原始劃分和遞歸劃分。其中，原始劃分把46 個單倍型和已知同源序列劃為6 組，劃分結果較穩定，而遞歸劃分把46個單倍型和已知同源序列劃分為7～8 組，劃分結果有波動。因此，選擇較穩定的原始劃分為參考，在P 為0.001～0.01 的范圍內，自動檢測出6 組，ABGD 劃分結果與系統進化分析結果在ABGD1和ABGD6出現偏差（圖2）。

圖2 ABGD軟件對高原鰍復合體的劃分結果Fig.2 Automatic partition results of Triplophysa complex based on ABGD

2.2.4 種間、種內遺傳距離分析 采用K2P 雙參數模型統計高原鰍復合體的種內、種間的遺傳距離（表3）：種內遺傳距離為0.000 6～0.019 2（平均為0.004 4），種間遺傳距離為0.005 1～0.159 8（平均為0.105 6）。系統發育樹上顯示的A、B 支的單倍型之間和G、H 支的單倍型之間具有較低的遺傳距離（0.005 1、0.005 3），同時A 支和B 支與已知擬硬刺高原鰍、麻爾柯河高原鰍、硬刺高原鰍序列間遺傳距離很低（0.002 3、0.001 8、0.004 2和0.004 8、0.003 5、0.000 9）；同樣，G 支和H 支與同源序列擬鯰高原鰍、黃河高原鰍也提示為種內距離標準（0.000 6、0.004 6和0.004 8、0.002 5）。

表3 高原鰍復合體基于cyt b基因序列的種內、種間遺傳距離Table 3 Genetic distance within-species and between-species of Triplophysa complex based on cyt b gene sequences

3 討論

3.1 cyt b 基因用于高原鰍屬魚類物種鑒定的有效性

mtDNA 在進化中表現為選擇中性，能夠解決由于趨同進化、可塑性引起的傳統形態分類方法難以界定的物種鑒定（Xiaoet al.，2001；Qiet al.，2015；Fenget al.，2019）。以往動物cyt b基因研究表明，遺傳距離超過6%的個體間已有明顯的亞種或種的分化（楊學干等，2001；Yanget al.，2002；王義權等，2004）。裂腹魚亞科Schizothoracinae 魚類的研究顯示，各指名種間基于cyt b基因序列的遺傳距離在1.33%～9.80%，種間平均遺傳距離明顯低于6%，這可能與高原魚類因青藏高原快速隆升所致的物種分化較晚有關（祁得林等，2006）。本研究中，綜合BLAST 同源比對、系統發育分析和ABGD 劃分結果顯示，盡管利用cyt b基因無法完全厘清ABGD1組和ABGD6組的物種，但大部分物種能夠準確鑒定，且被鑒定的物種間平均遺傳距離（0.105 6）是種內遺傳距離（0.004 4）的24 倍，符合Hebert 等（2004）提出的“10×規則”。因此，利用cyt b基因進行高原鰍屬魚類物種鑒定是可行的。

3.2 黃河上游高原鰍復合體的物種組成

種內、種間遺傳距離是進行物種鑒別的主要標準（周建設等，2019）。本研究結合遺傳距離結果和系統進化關系進行分析，進一步證實單系群C中的8 個單倍型（H23～29、H31）與相應已知序列（東方高原鰍）的遺傳距離為0.007 3，單系群D 的5 個單倍型（H10～14）與已知序列（隆頭高原鰍）的遺傳距離為0.019 2，單系群E 中的7 個單倍型（H3～9）與已知序列（斯氏高原鰍）的遺傳距離為0.001 3，單系群F 的1 個單倍型（H30）與已知序列（粗壯高原鰍）的遺傳距離為0.000 9，均能夠明顯呈現出種內個體間遺傳距離水平（Hellberget al.，2014），由此可確定單系支C 的8 個單倍型（H23～29、H31）隸屬于東方高原鰍，單系支D 的5 個單倍型（H10～14）屬于隆頭高原鰍，單系支E中的7個單倍型（H3～9）為斯氏高原鰍，單系支F的1個單倍型（H30）為粗壯高原鰍。這些單系群之間的平均遺傳距離為0.117 9，符合種間水平。在所采集樣本中，X3、X19 和X22 接近成體發育階段，X3 具有粗壯高原鰍的典型特征，而X19和X22具有隆頭高原鰍的典型特征，這與本研究中基于cyt b基因序列的物種鑒定相符。

資料表明（武云飛，吳翠珍，1992），麻爾柯河高原鰍僅分布在大渡河流域，鑒于本次樣本來自于黃河流域，因此麻爾柯河高原鰍可以從ABGD1組中排除。硬刺高原鰍和擬硬刺高原鰍在腸道和鰾后室結構上存在明顯差異，且擬硬刺高原鰍的背鰭最后1 根不分枝鰭條的粗硬部分少于硬刺高原鰍（武云飛，吳翠珍，1992）。成體階段，硬刺高原鰍因背部和體側上部具有黑褐色細斑紋而容易區分，如本研究中L5 和L16 均為成體，被鑒定為硬刺高原鰍，但在幼魚階段，這2 個物種很難區分。鑒于，單系群A 的11 個單倍型（H36～46）與其聚為一個支的擬硬刺高原鰍的遺傳距離（0.002 3）、以及與硬刺高原鰍的遺傳距離（0.001 8）很低，加之這2個物種在黃河上游廣泛分布（武云飛，吳翠珍，1992），本研究認為ABGD1 組可能是：由1 個物種組成，應將早期形態學分類中的硬刺高原鰍和擬硬刺高原鰍合并為硬刺高原鰍；由2個形態模糊種組成，但在今后的工作中需要結合分子手段和傳統形態學進一步厘清分類學地位。

對于ABGD6 組而言，樣本X15、X16 和W15 均為成體，具有擬鯰高原鰍頭部和軀干寬闊而扁平的典型特征，7 個單倍型（H1、H15～H20）可進一步明確為擬鯰高原鰍。黃河高原鰍支中H2、H21 和H22 樣品均為幼體，采樣時無法從形態學鑒定物種，但這3個單倍型與黃河高原鰍和擬鯰高原鰍序列的遺傳距離分別為0.000 6 和0.004 6，均顯示出種內水平。黃河高原鰍頭部特征與擬鯰高原鰍趨同，具有扁平的特征，但是黃河高原鰍成體軀干呈圓筒狀，因此，在幼魚至成體發育的過渡階段兩者的物種鑒定容易出現偏差。本研究認為GenBank中黃河高原鰍序列MG697453.1 可能屬于這種情況，實質上應該是擬鯰高原鰍。

高原鰍屬魚類在外形特征等方面表現出相似性，尤其是在幼魚階段很難用傳統的分類學方法進行鑒定，這可能與同域分布物種的趨同進化有關（Muschicket al.，2011；Qiet al.，2012）。無論如何，利用cyt b基因序列進行黃河上游高原鰍復合體進行分子鑒定，在一定程度上是可行的。本研究在黃河上游干流及支流湟水河流域5 個采樣點共95 個樣本中至少共鑒定到6 個物種，但cyt b基因作為核外遺傳物質，其信息量有限，特別是在近緣物種的分類研究中要慎重對待。