響應面分析法優化銀杏葉黃酮類化合物的提取工藝

倫琦 喬鏡澄 楊江南 劉海濤 武湘姝 文文

摘 要：以乙醇為浸提液，利用微波萃取輔助超聲法提取銀杏葉中總黃酮類化合物，通過單因素試驗以及響應面試驗設計優化提取工藝。結果表明，黃酮類化合物的最佳提取條件為乙醇濃度63.15%、超聲時間2.65 min、液料比116∶1（mL∶g）、微波時間3.83 min，該條件下銀杏葉中黃酮化合物提取量為28.36 mg·g-1。

關鍵詞：銀杏葉；黃酮；響應面分析法；工藝優化

Abstract： The total flavonoids in Ginkgo biloba leaves were extracted by microwave extraction-assisted ultrasonication using ethanol as the extracting solution， and the extraction process was optimized by single-factor test and response surface test design. The results showed that the optimum extraction conditions for flavonoids were 63.15% ethanol concentration， 2.65 min ultrasonic time， 116∶1 （mL∶g） liquid-to-material ratio and 3.83 min microwave time， and the extraction amount of flavonoids in Ginkgo biloba leaves was 28.36 mg·g-1 under these conditions.

Keywords： Ginkgo Biloba leaves; flavonoid; response surface methodology; optimization

銀杏葉提取物復雜的化學成分中主要起藥理活性作用的是黃酮類物質，其黃酮種類多達40種。黃酮類化合物生理活性多種多樣，具有治療心血管系統疾病、抗致病菌、消除炎癥、抗氧化、預防腫瘤等多重功效[1]。當前，銀杏葉總黃酮的提取方法有超聲輔助提取法[2]、超聲酶輔助提取法[3]和微波輔助提取法[4-5]等。研究表明，超聲波輔助提取法較強的空化效應可以破壞植物細胞壁的結構，加速物質的溶出。微波輔助提取法使得黃酮類化合物溶解性提高，有利于提取率的增加。當前，微波超聲聯合輔助提取銀杏葉黃酮報道較少。魏欣等[6]在提取棕櫚葉中酚酸時采用了微波超聲交替提取法，大大提高了提取效率。馮婧等[7]利用微波-超聲輔助聯合提取銀杏葉黃酮，提取率明顯提高，王娜等[8]利用超聲微波協同優化花生紅衣原花青素的提取，其提取率也獲得明顯提高。因此本文采用微波-超聲輔助聯合提取法，并利用響應面法優化試驗條件，提高了銀杏葉黃酮的提取率，降低微波的功率以減少微波熱效應對黃酮結構的損傷，為天然產物的高效提取及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏葉：采自天津天獅學院校園；蘆丁為優級純（中國藥品生物制品檢驗所，純度≥98%）；無水乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉。

1.2 儀器與設備

SONICS超聲波細胞粉碎機，上海芃奇科技儀器有限公司；微波催化合成萃取儀，上海比朗儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計，費爾伯恩實業發展（上海）有限公司；高速萬能粉粹機，上海科恒實業發展有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，松下電器有限公司。

1.3 總黃酮提取與測定

1.3.1 標準曲線的繪制

吸取蘆丁標準液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和6 mL置于25 mL容量瓶內，加蒸餾水至6 mL，加入5%亞硝酸溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度搖勻。測定OD510，繪制蘆丁與吸光度的標準曲線。

1.3.2 總黃酮提取

將烘干的銀杏葉磨成粉，過80目篩，保存在低溫避光的條件下。稱取銀杏葉粉末0.500 0 g，溶于60%乙醇，液料比120∶1（mL∶g），采用微波催化合成萃取儀處理，微波功率定為150 W，時間4 min。后置于超聲波細胞粉碎儀中處理，超聲間隙為2 s、超聲時間為2 s，超聲功率228 W，時間3 min。離心轉速1 500 r·min-1，離心處理時間5 min，取上清液備用[4，7]。

1.3.3 總黃酮含量測定

量取樣品處理液2 mL，置于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混勻，靜置6 min后，加10% Al（NO3）3溶液1 mL，混勻，靜置6 min。加4% NaOH試液10 mL，加水定容至刻度線，混勻，510 nm波長下測定吸光度。

1.3.4 總黃酮含量的計算

按1.3.1測得的吸光度值，得出標準曲線為y=0.011 8x+0.002（R2=0.999 7），利用公式（1）計算總黃酮類化合物的提取量[7]。

式中：A為OD510處的吸光值；B為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；m為銀杏葉干粉質量，g。

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 乙醇濃度

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，乙醇濃度分別為50%、55%、60%、65%和70%，溶液50 mL，液料比為1∶120（g∶mL）在微波功率為150 W下微波處理4 min，在超聲功率228 W下超聲3 min，離心取上清液。

1.4.2 超聲處理時間

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，液料比為120∶1（mL∶g），60%的乙醇溶液50 mL，在微波功率為150 W下微波處理4 min，超聲功率為228 W，超聲處理時間分別是1 min、2 min、3 min、4 min和5 min，離心取上清液。

1.4.3 微波處理時間

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，液料比為120∶1（mL∶g），60%的乙醇溶液50mL，在微波功率為150 W下微波處理時間分別為2 min、3 min、

4 min、5 min和6 min，超聲功率228 W下超聲處理3 min，離心取上清液。

1.4.4 液料比

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，液料比為60∶1、80∶1、100∶1、120∶1和140∶1（mL∶g），60%的乙醇溶液50 mL，微波功率為150 W，處理

4 min，在超聲功率228 W下超聲處理3 min，離心取上清液。

1.5 響應面優化方案

在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法以黃酮類化合物提取量為響應值，對黃酮化合物提取工藝進行優化，以獲得黃酮類化合物的最佳工藝參數[9]。水平因素設計如表1所示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度

由圖1可知，在液料比為120∶1（g∶mL），微波功率150 W下微波處理4 min，超聲功率228 W下超聲3 min的條件下，當乙醇濃度60%時黃酮化合物提取量為26.57 mg·g-1，此時提取量最高。

2.1.2 超聲處理時間

圖2表明，在液料比為120∶1（g∶mL），乙醇濃度為60%，微波功率150 W下微波處理4 min，

超聲功率228 W條件下，當超聲3 min時黃酮化合物提取量為28.36 mg·g-1，此時提取量最高。

2.1.3 微波處理時間

由圖3可知，在液料比為120∶1（g∶mL），乙醇濃度為60%，微波功率為150 W，超聲功率

228 W超聲處理3 min的條件下，當微波處理時間為

4 min時黃酮化合物提取量為26.42 mg·g-1，此時提取量最高。

2.1.4 液料比

由圖4可知，在乙醇濃度為60%，微波功率150 W下微波處理4 min，超聲功率228 W超聲處理3 min的條件下，液料比不同時黃酮類化合物提取量不同。當液料比為120∶1（mL∶g）時黃酮化合物提取量為26.60 mg·g-1，此時提取量最高。

2.2 響應面法優化

2.2.1 回歸方程及方差的分析

結合單因素實驗，利用Design expert 8.0軟件對乙醇濃度、超聲時間、液料比及微波時間4個因素來進行響應面試驗，結果如表2、3所示。

得到銀杏葉黃酮類化合物總提取量Y（mg·g-1）對A、B、C、D的二次多項回歸方程為Y=28.36-0.016A-0.54B+0.55C-0.55D+0.048AC-0.087BC+0.14BD+0.042CD-0.25A2-0.93B2-1.19C2-1.53D2，得到此模型的P＜0.000 1，證明此模型極顯著，回歸方程相關系數R2為0.989 5，模型擬合度較好，相關系數R2Adj=0.979 1，變異系數為0.6%，說明該回歸方程可以解釋97.91%的試驗數據。F=94.59，F值越大，變量對響應值的影響就越大。可以認為，該試驗中選取的4個因素對于銀杏總黃酮類的提取量具有一定的影響，可以利用該模型來得到銀杏葉黃酮的最佳提取條件。

2.2.2 響應面分析

圖5為各因素對響應值的影響，各因素對黃酮類化合物的影響的排序為D＞C＞B＞A，交互項對黃酮類化合物影響的排序為BD＞BC＞AC＞CD＞

AB=AD，二次項對黃酮類化合物影響的排序為D2＞C2＞B2＞A2，與方差分析結果相同。根據響應面分析得到的最優提取條件為乙醇濃度63.15%、超聲時間2.65 min、液料比116∶1、微波時間3.83 min，

預測的黃酮化合物提取量為28.38 mg·g-1。利用此最佳工藝條件提取銀杏葉內的總黃酮，得到的黃酮類化合物提取量為28.36 mg·g-1，與預測值較為符合。

3 結論

本文運用微波萃取輔助超聲聯合提取黃酮類化合物的方法顯著縮短了提取時間，提高了銀杏葉中黃酮類化合物的提取量。在單因素的基礎上，采用響應面法對銀杏葉中的黃酮類化合物提取工藝參數進行優化。結果表明，最佳提取工藝為乙醇濃度63.15%、超聲時間2.65 min、液料比116∶1（mL∶g）、微波時間3.83 min，此工藝條件下提取黃酮類化合物提取量為28.36 mg·g-1。

參考文獻

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