等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)快速檢測(cè)沙門氏菌的研究

梁振瑞 張薇 許紹坤 李鮮鮮 馮紅 自武全

摘 要：本文研究并建立等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)快速檢測(cè)沙門氏菌的方法。通過對(duì)沙門氏菌的SSAQ基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用最佳引物組搭配其他配套試劑建立一種針對(duì)沙門氏菌的等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)快速檢測(cè)方法；采用直擴(kuò)法提取DNA，通過等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)與常規(guī)PCR法對(duì)不同濃度沙門氏菌進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，檢測(cè)最低檢測(cè)限，對(duì)其靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，所建立的針對(duì)沙門氏菌等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)的方法與常規(guī)PCR法相比，等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)的方法靈敏度更高，且根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知該方法對(duì)沙門氏菌具有良好的特異性，所建立的針對(duì)沙門氏菌的等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)檢測(cè)方法具有操作快捷、簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間較短、良好的特異性和較高的靈敏度的特點(diǎn)，能夠用于沙門氏菌的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)；沙門氏菌；特異性；靈敏度

Abstract： A method for rapid detection of Salmonella by isothermal amplification fluorescence was developed. By designing primers for the conserved region of SSAQ gene sequence of Salmonella， an isothermal amplification fluorescence method for rapid detection of Salmonella was established by combining the best primers with other supporting reagents. The direct expansion method was used to extract DNA， and the isothermal amplification fluorescence technique and conventional PCR method were used to detect Salmonella with different concentrations. The minimum detection limit was detected， and the sensitivity was evaluated. The results showed that the established method for isothermal fluorescence amplification detection of Salmonella is more sensitive than the conventional PCR method， and it has good specificity for Salmonella based on interfering experimental results. The characteristics of this method are fast， simple， short reaction time， good specificity， and high sensitivity. It can be used for rapid detection of Salmonella.

Keywords： isothermal fluorescence amplification technology; Salmonella; specificity; sensitivity

沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，是常見的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500個(gè)以上[1-3]。人一旦攝入了含有大量沙門氏菌的食品，就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而導(dǎo)致食物中毒、急性腸胃炎等疾病，因此，沙門氏菌檢測(cè)是各個(gè)國(guó)家檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的必檢項(xiàng)目之一[4]。目前，檢測(cè)沙門氏菌的方法有很多，如酶聯(lián)免疫法[5]、PCR法等[6]，但這些檢測(cè)方法都存在檢測(cè)過程煩瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)的弊端[7]。近年來，隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的分析檢測(cè)方法迅速發(fā)展[8-9]。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的沙門氏菌檢測(cè)方法具有重要意義。

等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)是核酸等溫?cái)U(kuò)增和熒光技術(shù)結(jié)合的新型核酸診斷POCT技術(shù)，針對(duì)目的片段設(shè)計(jì)4～6條特異引物。使用DNA聚合酶，通過添加熒光染料實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)擴(kuò)增過程，分析實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物熔解曲線對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性或半定量。等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)對(duì)溫度精準(zhǔn)度要求低，只需要恒定溫度就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間。由于該方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于病原體的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病原菌

沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌、惡臭假單胞菌（簡(jiǎn)稱：SM、DC、JP、ZH、EC）由云南國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（昆明海關(guān)口岸門診部）提供。

1.2 主要儀器

電泳儀、電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠成像儀、OPG GENIE Ⅱ系統(tǒng)等溫?cái)U(kuò)增熒光系統(tǒng)（OptiGene公司）、恒溫水浴鍋、大龍移液器等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

采用菌液直接擴(kuò)增法提取DNA，按1∶1的比例加入裂解液與菌液混合，95 ℃水浴或金屬浴加熱5 min，備用。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)

利用美國(guó)NCBI提供的BLAST在線軟件分析沙門氏菌中的SSAQ基因目標(biāo)序列，結(jié)合快速熒光PCR法對(duì)目標(biāo)片段的要求，篩選出長(zhǎng)度為1 079 bp穩(wěn)定的保守區(qū)域，作為引物設(shè)計(jì)的目標(biāo)片段，并利用目標(biāo)片段序列作為引物探針，針對(duì)保守區(qū)使用Lamp Designer軟件設(shè)計(jì)引物SM-1，其包括1對(duì)內(nèi)引物（FIP，BIP）和1對(duì)外引物（F3，B3）。

1.3.3 等溫?cái)U(kuò)增熒光法的建立

向擴(kuò)增反應(yīng)管中加入2.5 μL沙門氏菌DNA，18.5 μL反應(yīng)液，4 μL引物，陰性對(duì)照加2.5 μL ddH2O，混勻。用GENIE Ⅱ設(shè)置擴(kuò)增程序65 ℃反應(yīng)40 min，熔解程序98～80 ℃，0.05 ℃為1個(gè)循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（1）特異性檢測(cè)試驗(yàn)。用等溫?cái)U(kuò)增熒光法對(duì)沙門氏菌和其他非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）菌株提取的DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增。

（2）靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10濃度檢測(cè)最低檢測(cè)限。取八連管，每管分裝18.5 μL Mix，

4 μL引物組，2.5 μL樣本，用ddH2O作陰性對(duì)照。65 ℃反應(yīng)40 min；熔解程序?yàn)?8～80 ℃進(jìn)行上機(jī)擴(kuò)增。

1.3.4 常規(guī)PCR檢測(cè)沙門氏菌

（1）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。向擴(kuò)增反應(yīng)管中加入1 μL沙門氏菌DNA（未稀釋），12.5 μL反應(yīng)液，2 μL引物（上游引物、下游引物各1 μL），9.5 μL ddH2O，混勻，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，以ddH2O代替，重復(fù)7次，設(shè)置程序開始運(yùn)行。完成電泳后，將凝膠塊放置凝膠成像儀中，觀察電泳條帶。

（2）靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度檢測(cè)最低檢測(cè)限。設(shè)置一個(gè)原液濃度、一個(gè)空白對(duì)照，分別對(duì)擴(kuò)增后不同濃度的沙門樣本進(jìn)行電泳分析，根據(jù)其條帶的亮度和清晰度分析其最低檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)完成后，使用BLAST軟件比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物序列與沙門氏菌基因高度重合，且未匹配到其他病原的序列信息，初步證明SM-1引物有比較高的特異性。

2.2 等溫?cái)U(kuò)增熒光法

2.2.1 特異性檢測(cè)試驗(yàn)

對(duì)沙門氏菌和其他4種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果只有沙門氏菌出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，起峰時(shí)間在30 min以內(nèi)，將時(shí)間延長(zhǎng)至1 h后其他樣本也未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明該試劑盒只針對(duì)沙門氏菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。

2.2.2 靈敏性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

由表1可知，當(dāng)樣本檢測(cè)濃度大于等于10-4時(shí)，本試驗(yàn)所建立的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法均能在30 min內(nèi)檢出；當(dāng)檢測(cè)濃度低于10-4時(shí)未出現(xiàn)完整的擴(kuò)增曲線，說明建立的等溫?cái)U(kuò)增熒光技術(shù)能快速檢測(cè)沙門氏菌的濃度為10-4，檢測(cè)限為5.28×10-2 ng·μL-1。

2.3 常規(guī)PCR檢測(cè)沙門氏菌的結(jié)果

2.3.1 PCR方法檢測(cè)沙門氏菌的重復(fù)性

對(duì)沙門氏菌的DNA（未稀釋）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)10次，均可見清晰明顯的288 bp大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果吻合，說明該引物重復(fù)性好。

2.3.2 PCR方法檢測(cè)沙門氏菌的靈敏度

菌液稀釋到10-3時(shí)候擴(kuò)增效果不穩(wěn)定，有微弱的條帶但時(shí)常不會(huì)顯現(xiàn)，因此判斷10-2為常規(guī)PCR的最穩(wěn)定的最低檢測(cè)濃度，檢測(cè)限為5.28 ng·μL-1，詳見圖1。與等溫?cái)U(kuò)增熒光法相比，檢測(cè)的靈敏度弱于等溫?cái)U(kuò)增熒光法。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法整個(gè)過程需4～5 d，且過程煩瑣[10]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在沙門氏菌診斷方法中具有較高的特異性和靈敏度，是沙門氏菌感染診斷中最具有應(yīng)用前景的一種方法。然而，常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)反應(yīng)環(huán)境要求較高，且檢測(cè)儀器笨重。因此，建立一種反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)單、特異性靈敏的方法至關(guān)重要。目前，等溫?cái)U(kuò)增熒光法是一種能在恒定溫度下進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病原物檢測(cè)、食品安全檢測(cè)和植物病原物的檢測(cè)等方面[11]，有著極為廣泛的應(yīng)用前景。

本文測(cè)試了4種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本方法只對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果呈陽性，而對(duì)4種非沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果呈陰性，表明該方法特異性良好。同時(shí)梯度稀釋方法進(jìn)行沙門氏菌的靈敏度試驗(yàn)，并與常規(guī)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的等溫?cái)U(kuò)增熒光法檢測(cè)沙門氏菌的靈敏度為5.28×10-2 ng·μL-1，而常規(guī)PCR的檢測(cè)限為5.28 ng·μL-1，比常規(guī)PCR靈敏100倍。

等溫?cái)U(kuò)增熒光法不需要反復(fù)變換溫度，檢測(cè)速度、易攜性等方面比PCR有很大的優(yōu)勢(shì)，有著操作簡(jiǎn)單、快速、敏感性和特異性好等特點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景，是病原檢測(cè)的一項(xiàng)重要技術(shù)。

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