訶子砂燙炮制工藝及砂燙訶子中鞣花酸提取工藝研究

郝季,鞠成國,張強,安悅言,王巍

(遼寧中醫藥大學藥學院,遼寧 大連 116600)

訶子為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)或絨毛訶子(T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.)的干燥成熟果實[1]。古籍記載,訶子“生用斂肺利咽,煨熟固腸止瀉”[2]?；瘜W研究表明,訶子中主要含有鞣質類、多酚類、三萜類及多糖類;其中鞣質類約占總含量的23.60%～37.37%[3],主要為可水解的沒食子鞣質和鞣花鞣質,前期研究表明,訶子經炮制后其所含鞣質類成分一定程度向沒食子酸和鞣花酸轉化。鞣花酸是一種多酚二內酯,具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[4]。前期藥理研究表明,訶子炮制后治療潰瘍性結腸炎作用增強,該作用與鞣花酸含量增高有關[5]。潰瘍性結腸炎的臨床癥狀表現為黏液膿血便、腹瀉、腹痛及里急后重等,與中醫學中“腸澼”相對應[6],而訶子煨熟固腸止瀉,主要用于腸澼的治療,因此試驗結果提示訶子炮制后鞣花酸含量增高可能是其“煨熟固腸止瀉”的原因之一。

古籍中記載的訶子炮制方法多為“煻灰火煨”,現代炮制方法主要有炒法、麩煨法、砂燙法;其中砂燙法可通過河砂包埋傳遞熱量,這與古代的“煻灰火煨”最為接近。此研究以鞣花酸為指標優化訶子砂燙炮制工藝參數以及砂燙訶子中鞣花酸提取工藝參數,為解析訶子炮制原理提供實驗依據,并為訶子的臨床應用及抗潰瘍性結腸炎有效藥物的開發奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器 1100高效液相色譜系統(美國Agilent公司);FA1004B分析天平(上海精密科學儀器有限公司);XMTD7000電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 材料 訶子藥材,產地廣西,購于河北安國藥材市場,經遼寧中醫藥大學藥學院翟延君教授鑒定為使君子科植物訶子(T.chebulaRetz.)的干燥成熟果實;鞣花酸對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司(含量測定用,純度>98%,批號為MUST-14031010);甲醇為色譜純,乙醇、甲酸為分析純,水為超純水。

2 方法與結果

2.1 HPLC含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Platisil(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:甲醇-水-甲酸(45∶55∶0.2);體積流量1 mL·min-1;等度洗脫。柱溫30 ℃;檢測波長270 nm,進樣體積10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的鞣花酸對照品適量,加甲醇配制成對照品貯備液。精密吸取貯備液適量,配制得含鞣花酸0.007 667 mg·mL-1的對照品溶液,備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取砂燙訶子藥材粉碎,過65目篩,取0.1 g,精密稱定,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理30 min,取出,放涼,再次稱重(若有減失,以甲醇補足失重),濾過,取續濾液,稀釋5倍,經0.45 μm的微孔濾膜濾過,即得。

2.1.4 專屬性試驗 取甲醇空白溶劑、供試品溶液和對照品溶液,分別按“2.1.1”項下色譜條件,記錄HPLC圖。甲醇空白圖譜與供試品、對照品圖譜中鞣花酸相應的保留時間無其他峰干擾,說明色譜專屬性良好,詳見圖1。

A.供試品溶液;B.對照品溶液圖1 專屬性試驗色譜圖

2.1.5 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液適量,以甲醇溶解并逐步稀釋,使得鞣花酸濃度分別為38.33、19.17、9.58、4.79、2.40、1.20、0.60 μg·mL-1,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)繪制回歸方程。得到線性方程Y=87 435X-4.054,r=0.999 8。結果表明鞣花酸在質量濃度0.60～38.33 μg·mL-1內與其峰面積線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次,得鞣花酸峰面積的RSD為1.46%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取按“2.1.3”項下供試品溶液,于室溫放置0、2、4、8、12、24 h,按“2.1.1”項下色譜條件進樣,得鞣花酸峰面積的RSD為0.08%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。結果,鞣花酸的含量為33.07 mg·mL-1,RSD為0.87%(n=6)。表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取訶子粉末6份各0.05 g,精密稱定,加入相當于樣品中成分含量100%鞣花酸對照品,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。結果,鞣花酸的平均回收率為 99.12%,RSD為0.46%(n=6)。

2.2 訶子砂燙炮制工藝優化

2.2.1 正交試驗與結果 以鞣花酸含量為考察指標,選擇炮制溫度(A)、炮制時間(B)、翻埋頻率(C)為考察因素,采用L9(34)正交表進行設計。訶子炮制工藝因素水平表見表1,正交試驗結果見表2,方差分析結果見表3。

表1 訶子炮制工藝正交因素水平表

由表2可知,各因素對鞣花酸含量影響大小順序為 A>C>B,由表3可知,3個因素各水平之間均無顯著差異(P>0.05)。結合直觀分析,炮制溫度(A)在260 ℃和280 ℃鞣花酸含量相差不大,從節約能源考慮,選用260 ℃即可;炮制時間為第2水平即6 min、翻炒頻率為第3水平即40次/min,鞣花酸含量最大。因此,確定最佳工藝為A2B2C3,即炮制溫度260 ℃,炮制時間6 min,翻埋頻率40次/min。

表2 訶子炮制工藝正交試驗直觀分析

表3 訶子炮制工藝正交試驗方差分析結果

2.2.2 炮制工藝驗證試驗 取3份訶子藥材各300 g,按“2.2.1”項下最佳工藝條件進行炮制,按“2.1.3”項下條件進行提取驗證。結果顯示,鞣花酸含量分別為32.13、32.33、33.04 mg·g-1,RSD為1.47%(n=3),表明該炮制工藝穩定,重復性良好。

2.3 訶子炮制后鞣花酸提取工藝優化

2.3.1 正交試驗設計 以出膏率、鞣花酸提取量、膏中純度為考察指標,選擇粒徑(A)、液料比(B)、提取時間(C)和提取次數(D)為考察因素,以95%乙醇為溶劑,采用冷浸法按L16(45)正交表進行試驗。鞣花酸提取工藝的因素水平表見表4。

表4 鞣花酸提取工藝正交因素水平表

2.3.2 層次分析(AHP)法確定權重系數 試驗采用1～9標度法對出膏率、鞣花酸提取量、膏中純度這3項指標進行兩兩比較評價其重要性[7],各指標成分的評價標準見表5,因鞣花酸提取量與膏中純度同樣重要,相對權重記為1,鞣花酸提取量相對于出膏率稍重要,相對權重記為3,指標層次比較判斷優先矩陣見表6。得到出膏率、鞣花酸提取量、膏中純度的權重系數分別為0.142 9、0.428 6、0.428 6;一致性比率因子CR=CI/RI=0.000<0.10,具有一致性,表明權重系數有效。

表5 評價指標各層次評分標準

表6 指標層次比較判斷優先矩陣

2.3.3 指標重復性相關(CRITIC)法確定權重系數 CRITIC法屬于客觀賦值法,確定指標權重時首先將數據進行歸一化處理,后用SPSSAU軟件進行CRITIC分析,得到出膏率、鞣花酸提取量、膏中純度權重系數分別為0.368 2、0.197 3、0.434 5。

2.3.5 3種權重分析法比較 分別用AHP、CRITIC、AHP-CRITIC 法的權重系數對正交試驗結果進行綜合評分,結果見表7。通過SPSS 17.0軟件對得到的綜合評分進行相關性分析,結果AHP法與CRITIC法相關系數為0.992,AHP法與AHP-CRITIC法為0.991,CRITIC法與 AHP-CRITIC法為0.969,三者間的相關性均顯著(P<0.05),表明3種評分結果具有一致性[8]。對AHP法與CRITIC法的權重系數進行相關系數分析,相關系數為-0.247,呈負相關,其相關性不顯著(P>0.05)。AHP-CRITIC法綜合了AHP法和CRITIC法優點,平衡了主觀因素和客觀因素,所得的指標權重更可靠、更合理,因此選用AHP-CRITIC進行綜合權重評分[9]。

2.3.6 正交實驗結果與分析 根據AHP-CRITIC法的權重系數進行綜合評分,采用SPSS 17.0軟件進行數據分析,見表8～9。

由極差分析可知,各因素對鞣花酸提取工藝的主次為D>B>C>A。由方差分析可知,4因素各水平之間均無顯著性差異(P>0.05)。根據直觀分析結果確定最佳提取工藝為A4B3C4D4,即粒徑120目,液料比10∶1倍,提取時間24 h,提取次數4次。

表7 3種權重系數綜合評分

表8 正交試驗綜合評分直觀分析

表9 正交試驗方差分析結果

2.3.7 提取工藝驗證試驗 取3份按“2.2.3”工藝炮制后的訶子20 g,其中1#、2#、3#按“2.3.6”項下最佳工藝條件進行提取。由于正交試驗最優工藝為提取4次,驗證試驗中同時做了減少提取次數的比較驗證(4#),用于考量減少提取次數縮短工時的可能性。結果表明按最佳工藝進行提取綜合評分為99.4,RSD為0.19%(n=3),表明該提取工藝穩定,重復性良好;提取3次的驗證試驗結果綜合評分為79.6,表明減少提取次數對提取效率產生較為顯著的影響,因此以提取4次為宜。驗證試驗結果見表10。

表10 提取工藝驗證試驗結果(n=3)

3 討論

3.1 工藝考察 對砂燙訶子炮制工藝中炮制溫度、炮制時間進行了考察;發現炮制溫度260 ℃、炮制時間6 min鞣花酸含量最高,可能是由于炮制溫度過高、炮制時間太長使其發生炭化使鞣花酸含量降低。

鞣花酸提取工藝中對提取方式、提取溶劑、粒徑、液料比、提取時間進行了考察,發現采用冷浸法以95%乙醇為提取溶劑、粒徑120目、液料比10∶1、提取24 h,鞣花酸含量最好。

3.2 層次分析 提取工藝優化中選取出膏率、鞣花酸提取量和膏中純度3個指標進行評價,采用層次分析法和CRITIC法優化各指標的權重系數。層次分析法屬于主觀賦值法,可以將復雜問題進行定量、定性分析,分析影響因素,劃分影響因素組別,建立判斷矩陣,得出不同方案重要性程度的權重,為最佳方案的選擇提供依據[10]。CRITIC法屬于客觀賦值法,是定量的分析方法,通過數據自身攜帶的信息分析指標間的客觀規律,并量化指標間的關系,確定權重,使計算結果更加合理,但未能考量各指標的輕重關系,所以最終選用AHP-CRITIC法與正交試驗結合來確定最優工藝[11]。

4 結論

在單因素試驗基礎上,篩選出訶子砂燙炮制工藝的重要影響因素并采用正交試驗設計優化訶子砂燙炮制工藝參數,并驗證炮制工藝可行性。在單因素試驗基礎上運用正交試驗設計優選砂燙訶子鞣花酸提取工藝,并對鞣花酸提取工藝進行驗證。所得訶子砂燙炮制工藝及砂燙訶子中鞣花酸提取工藝穩定可靠,可用于訶子的炮制及鞣花酸的提取。