金蓮花黃酮類成分抗菌及抗氧化活性研究

劉藝苑,劉傳敏,李新朋,康悅,陳虞超,郭生虎,李艷蕊,張錦添,劉姝,薛濤*,張波*

(1.臨沂大學醫學院,山東 臨沂 276005;2.江蘇省農業科學院獸醫研究所,江蘇 南京 210014;3.寧夏農林科學院農業生物技術研究中心,寧夏 銀川 750002)

金蓮花為毛茛科植物金蓮花(TrolliuschinensisBge.)的干燥花,廣泛分布于西南、西北、華北、東北地區。該藥始見于《本草綱目拾遺》[1]且被《中國藥典》1977年版(一部)收錄[2]。現代藥理研究表明,金蓮花具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用,臨床上主要用于治療感冒、發燒、慢性扁桃體炎、急性鼓膜炎、尿路感染等炎癥[3]。

金蓮花主要含黃酮類、酚酸類和生物堿類成分,其中金蓮花含黃酮類成分含量豐富,約為10%～20%,黃酮苷類結構是金蓮花黃酮類成分的主要結構類型,少數為黃酮醇、二氫黃酮和黃酮氧糖苷類結構[4-6]。目前已從金蓮花中鑒定出黃酮類成分約99種,主要包括葒草苷、牡荊苷、金絲桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、鼠尾草素等[7]。其中葒草苷占總黃酮比例約10%,而牡荊苷占總黃酮比例約2%,是目前金蓮花中研究最廣泛的兩種黃酮類成分[8]。

抗菌及抗氧化活性是評價清熱解毒類中藥質量的重要活性指標,也是發掘清熱解毒類中藥活性物質基礎的重要途徑,因此本項研究以金蓮花黃酮類成分(總黃酮、葒草苷、牡荊苷)為研究對象,通過體外抑菌活性試驗探索金蓮花抗菌活性及其物質基礎,并通過黃酮類成分的抗氧化活性初步研究其抗菌機制,該研究可為基于金蓮花的新藥開發提供參考。

1 材料和儀器

1.1 材料及試劑 金蓮花由寧夏農林科學院提供,經郭生虎教授鑒定為毛茛科植物金蓮花(TrolliuschinensisBge.)的干燥花;蘆丁(CAS:153-18-4,純度:98%)、葒草苷(CAS:28608-75-5,純度:98%)、牡荊苷(CAS:3681-93-4,純度:98%)標準品購自成都埃法生物科技有限公司;菌株大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變異鏈球菌、鏈霉菌、紅酵母、黑曲霉、白色念珠菌等來自本實驗室保存。

硝酸鋁、鄰苯三酚、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、水楊酸、FeSO4·7H2O、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等均購自上海麥克林生化科技有限公司;麥氏比濁管,購自常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 儀器 旋轉蒸發儀(德國IKA公司);無菌超凈臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);SILFTA型熒光酶標儀(美國BioTek公司);UV-5500紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司);FA1204N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 金蓮花總黃酮的提取及其含量的測定

2.1.1 金蓮花中總黃酮的提取 準確稱取600 g經預處理的金蓮花,按照料液比1∶10,加入60%的乙醇,于90 ℃下回流提取兩次,每次1.5 h,趁熱過濾,合并濾液。用旋轉蒸發儀濃縮液體,溫度為65 ℃,然后乙醇沉淀,靜置過夜,除去沉淀部位,取上清液,再次濃縮,冷凍干燥后即得金蓮花總黃酮。

2.1.2 標準曲線的建立 分別精確移取100 μg·mL-1的蘆丁標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于7個20 mL比色管中,并進行編號0～7。每個比色管中補加60%乙醇溶液至1 mL。在每個比色管中加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置6 min。再加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,搖勻混合液,放置6 min,加入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液10 mL,加水至終體積20 mL,搖勻顯色,放置15 min。以0號試管為空白,光程1 cm,使用紫外分光光度計,測定510 nm處的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標,蘆丁質量濃度(μg·mL-1)為縱坐標,采用線性回歸法計算出標準曲線的回歸方程。

2.1.3 金蓮花總黃酮含量的測定 取30 mg樣品,用50 mL 60%的乙醇溶解,過濾。按“2.1.2”項下的方法處理后在510 nm處測定吸光度,并計算出其含量。

2.2 體外抑菌試驗

2.2.1 培養基的配制 將M-H瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)等滅菌后進行澆板,每個培養皿內澆注25 mL約4 mm厚的培養基,待培養基凝固后備用。

2.2.2 菌濃度的確定 按0.5號麥氏比濁管的操作方法,將9種待測的試驗菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變異鏈球菌、鏈霉菌、紅酵母、黑曲霉、白色念珠菌的菌濃度調整到3×108CFU·mL-1備用。

2.2.3 管碟法進行抑菌試驗 確定各待測樣品濃度為30 mg·mL-1。稱取一定量的金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷,用10%的二甲基亞砜(DMSO)溶解,同時細菌設1.25 mg·mL-1阿莫西林作陽性對照,真菌設2.5 mg·mL-1的伊曲康唑做陽性對照,10%的DMSO作為陰性對照。

將確定好濃度的各試驗菌液200 μL移入凝固好的平板中,使用涂布棒涂布均勻。用鑷子夾取牛津小杯置于含菌平板上,加入待測樣品。37 ℃培養24～48 h,每個樣品重復3次。同時設立陽性和陰性對照。結果判斷用游標卡尺精確量取,根據抑菌圈的直徑大小判斷該菌對藥物的敏感程度。

2.3 MIC和MBC的測定

2.3.1 混懸液的制備 經純化鑒定后,將試驗菌接種在液體培養基中,搖菌至對數生長期后,按照0.5號麥氏比濁管操作方法,將菌液濃度稀釋后調整到1.5×106CFU·mL-1,備用。吸取1 mL上述菌液加入1 mL培養液中,充分混勻后,即得到混懸液。

2.3.2 MIC及MBC的測定 首先,將金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷3種待測樣品分別溶解于10% DMSO溶液中。將各待測樣品進行倍比稀釋。分別取稀釋后的各梯度樣品100 μL逐個加入96孔平板中;然后再各孔中加入100 μL混懸液,充分混勻(菌液終濃度為3.75× 105CFU·mL-1),每個濃度設置3個平行樣品,同時設立陽性和陰性對照。此時各孔中金蓮花總黃酮和葒草苷的濃度梯度分別為:2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 mg·mL-1;牧荊苷的濃度梯度分別為:25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg·mL-1。調整后恒溫37 ℃培養24 h后,取出96孔板,并對各個孔進行逐個檢查,用肉眼觀察其渾濁程度。如果某孔的培養液出現膜狀物或渾濁為“+”;無膜狀物且澄清透明為“-”。從96孔板上取MIC以上各孔100 μL,分別涂布在固體培養基上,在相同條件下培養24 h。培養平皿中無菌生長的樣品最小濃度定義為該樣品的MBC。

2.4 抗氧化能力的測定

2.4.1 羥自由基清除能力的測定 采用水楊酸法[9]測定金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷3種成分的羥基自由基清除能力。在10 mL比色管中依次加入1 mL 6 mmol·L-1FeSO4,1 mL樣品溶液,1 mL 6 mmol·L-1H2O2,混勻后室溫放置10 min,最后加入6 mmol·L-1乙醇-水楊酸,搖勻,37 ℃水浴加熱15 min后取出,于510 nm處測其吸光值。并依據式(1)進行計算。

羥自由基清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(1)

其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以蒸餾水代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以蒸餾水代替H2O2。

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚法[10]測定金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷3種成分的超氧陰離子自由基清除能力。分別向10 mL離心管中分別依次加入0.1 mol·L-1Tris-HCl溶液4.5 mL,蒸餾水2.4 mL,不同濃度的樣品溶液1 mL,混勻,室溫反應10 min后加入0.1 mL 10 mmol·L-1HCl終止反應,于325 nm處檢測吸光值。并依據式(2)進行計算。

超氧陰離子清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(2)

其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以蒸餾水代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以蒸餾水代替鄰苯三酚。

2.4.3 DPPH自由基清除能力的測定 向10 mL比色管中分別加入2 mL樣品,然后加入2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,混勻后室溫避光反應30 min,517 nm測定吸光值。無水乙醇調零。并依據式(3)進行計算。

DPPH清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(3)

其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以無水乙醇代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以無水乙醇代替DPPH。

3 實驗結果

3.1 金蓮花總黃酮含量的測定 以蘆丁質量濃度為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y),標準曲線方程為Y=0.000 6X-0.000 3,R2=0.999 3,結果表明在10～60 μg·mL-1范圍呈現比較好的線性關系。經計算樣品中總黃酮的濃度為32.18 μg·mL-1,含量為64.3%。

3.2 體外抑菌試驗結果 試驗結果表明,在30 mg·mL-1的作用濃度下,金黃色葡萄球菌對金蓮花總黃酮、葒草苷中度敏感,對牡荊苷低度敏感(見表1);變異鏈球菌對葒草苷中度敏感,對金蓮花總黃酮、牡荊苷低度敏感(見表2)。其他待測菌如傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、鏈霉菌以及紅酵母、黑曲霉、白色念珠菌對金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷均不敏感。

表1 待測樣品對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗結果

表2 待測樣品對變異鏈球菌的體外抑菌試驗結果

3.3 MIC和MBC的測定結果 金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對變異鏈球菌MIC值分別為0.312 5、0.156 25、3.125 mg·mL-1。金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對金黃色葡萄球菌MIC值分別為0.156 25、0.156 25、6.25 mg·mL-1。金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對變異鏈球菌MBC值分別為1.25、0.625、12.5 mg·mL-1。金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對金黃色葡萄球菌MBC值分別為0.625、0.625、25 mg·mL-1。結果表明,金蓮花總黃酮對變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌表現出較強的抑菌和殺菌效力,其主要成分葒草苷比牡荊苷表現出更強的抑菌和殺菌效力。

3.4 抗氧化能力測定結果 金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對超氧陰離子、DPPH和羥基自由基的清除效果見表3。

由表3可知,金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對3種自由基均表現出較好的清除能力,其中對超氧陰離子的清除能力,牡荊苷>葒草苷>總黃酮;對羥基自由基和DPPH的清除能力,總黃酮>葒草苷>牡荊苷。從總體來看,其主要成分葒草苷的抗氧化活性優于牡荊苷。

表3 金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷抗氧化活性結果

4 討論

金蓮花顆粒、金蓮花膠囊等為臨床常用清熱解毒類中成藥,但其君藥金蓮花的藥效物質基礎尚不明確。黃酮類成分是目前金蓮花研究最為廣泛且含量相對較高的一類成分,本實驗結果表明,金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對細菌的抑制作用要優于真菌;對革蘭陽性細菌的抑制作用優于革蘭陰性細菌。可能與黃酮類物質本身所具有的酚羥基的結構有關,使其具有酚類的通性,具有類似苯酚的抑菌作用;同時黃酮類物質可以使溶液呈弱酸性,也不利于細菌的生長。

金蓮花主要抑菌對象是革蘭陽性細菌,因此推測金蓮花主要有效抑菌成分的作用部位可能在于細菌的細胞壁上。本實驗中,葒草苷對革蘭陽性細菌變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌均表現出較強的殺傷效力,殺菌效果明顯優于金蓮花總黃酮和牡荊苷。

抗氧化實驗研究發現,金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對3種自由基均表現出一定的清除能力,但葒草苷抗氧化活性整體上優于牡荊苷,與其抗菌效果一致,說明抗氧化可能是其潛在抗菌機制之一。本研究亦證實金蓮花黃酮類主要成分葒草苷是金蓮花清熱解毒活性的有效成分之一。