銅摻雜介孔硅載雙硫侖抗腸癌活性研究

熊彬,張思艷,孟奇,魏亮,姜守剛

(1.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040;2.東北林業大學化學化工與資源利用學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

腸癌不僅為高發癌癥之一,并且被發現時多為晚期,手術難度較大,故化療成了治療的主要方式[1-3]。近年來,老藥新用成為越來越熱門的話題。雙硫侖,又名戒酒硫,臨床主要用于臨床治療酒精依賴癥,現在越來越多的研究證實雙硫侖(DSF)具有廣譜抗腫瘤活性,并且在抗腸癌中也具有一定效果[4]。雙硫侖的抗腫瘤活性與銅離子(Cu2+)密切相關,銅離子能明顯提高雙硫侖的抗腫瘤活性[5]。但雙硫侖和雙硫侖的銅絡合物(CuET)在體內條件下均不穩定,生物利用度低,腫瘤靶向輸送能力差。介孔硅具有穩定的骨架結構、無生理毒性、較大的比表面積和孔容量、緩釋藥物和易于修飾等優點[6]。而銅摻雜的介孔二氧化硅不僅能為雙硫侖提供銅離子,也能加速介孔硅的降解,減少對人體的損害[7]。基于DSF的抗腫瘤活性和介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)的易于修飾且低毒的特性,本實驗探討了Cu-MSNs載雙硫侖的抗腸癌作用。

1 材料與儀器

1.1 材料 硅酸四乙酯和卡培他濱(麥克林);無水乙醇(富宇試劑);三乙醇氨和5-氟尿嘧啶(阿拉丁);雙硫侖(上海源葉生物科技公司);RPMI1640培養基、青霉素-鏈霉素和胰酶(HyClone);非必需氨基酸(博奧拓達);氨水(25%,天力);DMSO(碧云天生物);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);結腸癌CT26.WT細胞(北京協和醫院細胞中心)。

1.2 儀器 DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);手提式壓力蒸汽滅菌器XYR2015-N576(浙江新豐醫療器械有限公司);超聲波清洗機(潔盟);Scientz-10N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);78HW-1數顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司);FA1204B分析天平和QP-80型二氧化碳細胞培養箱(濟南好寶來醫療器材有限公司);ST40R型離心機(上海實維實驗儀器技術有限公司);CX43生物顯微鏡(南京瞭望光電技術有限公司);SW-CJ-3F型生物工作臺(上海滬凈醫療器械有限公司);掃描電鏡Quanta-200 (荷蘭FEI公司);高效液相色譜儀2489(Waters 公司) 。

2 方法

2.1 二氧化硅微球的制備 采用Stober法制備二氧化硅微球[8],將10 mL的去離子水加入到50 mL的乙醇中,然后加入2.5 mL的氨水在55 ℃下水浴攪拌(1 000 r·min-1)3.5 h,期間緩慢滴加1.5 mL的硅酸四乙酯,將生成的白色產物離心收集(12 000 r·min-1),再用去離子水和乙醇分別洗3次白色產物。

2.2 二氧化硅空心微球的制備和銅摻雜 將二氧化硅微球(70 mg)和三水硝酸銅以1∶2.6的質量混合加入到50 mL的去離子水中,期間滴加6 mL的氨水,在室溫下攪拌30 min,然后將所得的溶液加入到100 mL的反應釜中,在140 ℃下反應10 h,之后將所得產物分別用水和乙醇洗3次,得到的藍色產物(Cu-MSNs)[9]。

2.3 雙硫侖的載藥 將適量雙硫侖溶解于20 mL乙醇中,加入50 mg載體。超聲1 h后劇烈攪拌過夜。離心收集上清液和沉淀,得到的DSF-Cu-MSNs(DSF-NPs)沉淀凍干后備用。

2.4 CuET檢測 將5 mg的DSF-NPs加入到適量氯仿中,超聲1 h后離心收集上清液,得到具有溶出介質的上清液。之后用紫外光譜儀全波長掃描,得到溶出介質的紫外圖譜。

2.5 形貌觀察 本實驗采用SEM掃描電鏡觀察MSNs和Cu-MSNs的形貌以及粒徑大小。

2.6 制備工藝的優化 粒徑是一個評價納米粒質量的重要標準,合適粒徑的納米粒會對藥物的釋放和生物利用度等因素起到重要作用[8,10]。本實驗將采用單因素法控制變量,對二氧化硅微球的制備進行優化。主要優化的有氨水和水的量和反應溫度,每個條件設置5個梯度3組平行。

2.7 載藥量、包封率和體外釋放的測定

2.7.1 DSF標準曲線的制備 本實驗采用色譜法對雙硫侖的標準曲線進行測定。

2.7.2 色譜條件 依利特C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相為甲醇-水(80∶20),流速為1.0 mL·min-1;檢測波長為275 nm;柱溫為30 ℃;進樣量:10 μL[11]。

2.7.3 標準品溶液的制備 取10 mg DSF標準品加入到10 mL容量瓶中,加入甲醇配制成1 mg·mL-1的標準品溶液,梯度稀釋至100、120、140、160、180和200 μg·mL-1。測定吸收峰面積后得到DSF的標準曲線。

2.7.4 載藥量的測定 取上清液(見“2.7.3”項下)逐級稀釋測定其吸光度,計算其濃度后利用差減法得到載藥量[12]。公式如下:

(1)

2.7.5 體外釋放 將2 mg的DSF-NPs加入到透析袋(3 500 Mw)中,透析袋置入50 mL PBS緩沖液中(0.01 mol·L-1,pH=7.4,2%SDS),之后放入旋轉搖床中孵育(37 ℃,100 r·min-1),按照設定的時間(0.5、1、2、4、6、12,24、48、72 h)每次取出5 mL溶液測定濃度計算累計釋放量,并添加5 mL PBS緩沖液[13]。

(2)

(3)

(4)

其中,Ci為每個時間點所取透析液中的DSF濃度;Ci′是相鄰兩個時間點所取透析液DSF濃度增加的量;V為燒杯中透析液總體積;Vi為每次取透析液體積;M為加載在納米粒中DSF的質量;Q為DSF的累計釋放量。

2.8 體外實驗

2.8.1 細胞培養 將凍存的CT26.WT細胞解凍、離心(1 800 r·min-1,7 min)后撇去上清,將細胞用含胎牛血清的RPMI 1640培養液(5 mL)輕輕吹散后移入培養瓶中。CO2培養箱中培養直至長滿培養瓶后用胰蛋白酶消化,用培養液輕輕吹打、吹散細胞。以用于后續實驗、傳代和凍存。

2.8.2 MTT細胞毒性實驗 本實驗取用對數周期的CT26.WT細胞進行消化,重懸沉淀后稀釋至細胞計數2.5×104個/mL。以每孔200 μL加入到96孔板中(邊緣孔加入PBS緩沖液以防止邊緣效應)。在CO2培養箱中過夜培養。待細胞貼壁后,將DSF、DSF-Cu-MSNs、5-FU以配置好的濃度加入到96孔板中(設置3～5個復孔),培養48 h、72 h后加入20 μL的MTT溶液(5 μg·mL-1,PBS溶解),繼續培養4 h后小心棄置上清液并加入150 μL的DMSO溶液,在水平振蕩器上振蕩5～10 min后在490 nm處測定吸光度[14-15]。根據以下公式計算細胞抑制率:

(5)

3 結果

3.1 二氧化硅微球的工藝優化 如圖1所示氨水和水對二氧化硅微球影響不成梯度變化;但隨著溫度的逐漸增大,粒徑也隨之減小。在梯度范圍內最佳氨水、水和溫度為:1.5 mL、12.5 mL和85 ℃。

A.氨水;B.水;C.溫度圖1 不同因素對二氧化硅微球粒徑的影響

3.2 二氧化硅的銅摻雜 DSF-NPs在結合能943、968 eV具有吸收峰(見圖2),符合Cu2p3/2在結合能934.6 eV處有吸收峰且與其他物質結合后吸收峰會分裂[16]。

圖2 銅摻雜介孔硅的XPS能譜

3.3 MSNs和Cu-MSNs的形貌觀察 采用SEM對MSNs和Cu-MSNs的形貌進行觀察,由圖3可以看出MSNs和Cu-MSNs呈現規則的圓球形,且粒徑處于120～160 nm之間。

A、C.MSNs;B、D.Cu-MSNs A、B.×50 000;C、D.×200 000圖3 MSNs和Cu-MSNs的掃描電鏡圖像

3.4 載藥量的測定

3.4.1 線性關系考察 DSF標準品溶液在梯度范圍內與峰面積成良好的線性關系(Y=15.123X-76.142,R2=0.999 1)。

3.4.2 載藥量 將供試品溶液(n=3)逐級稀釋測量峰面積,直至測出合適的峰面積,代入DSF標準曲線Y=15.123X-76.142中可得上清液中的DSF含量,利用差減法可求得Cu-MSNs中DSF的含量,再利用公式(1)可求得載藥量為9.51%±1.04%。

3.5 藥物的體外釋放 由圖4得知,Cu-MSNs包載DSF在48 h內釋放量僅為15.5%±1.2%,而72 h時為31.2%±1.8%。說明Cu-MSNs包載DSF具有良好的緩控釋效果,DSF能與骨架中的Cu絡合形成CuET,增加穩定性減緩DSF的釋放。而隨著載體骨架的降解釋放的Cu2+能與DSF形成CuET,而CuET是主要的殺滅腫瘤細胞的活性物質[17],所以用Cu-MSNs包載DSF能更好的增強抗腫瘤效果。

圖4 DSF的體外釋放曲線

3.6 CuET的檢測 對DSF-NPs溶液超聲、離心后的上清液進行全波長掃描后得到圖5。有研究證明雙硫侖的吸收峰在234 nm處有吸收峰,435 nm處沒有吸收峰,而CuET在435 nm處有吸收峰[17]。由圖5可知含溶出介質上清液在435 nm處有較強吸收峰,證明生成了CuET。

3.7 體外抗腫瘤活性 本實驗采用MTT毒性實驗探究不同濃度5-Fu、DSF和DSF-NPs在48 h和72 h對CT.26WT細胞的抑制作用。隨著藥物濃度和時間的增大,對CT.26WT細胞的抑制作用也越強,呈現出濃度和時間的相關性。在48 h和72 h下,相較于DSF和5-Fu組,DSF-NPs的IC50值更小,進一步證明了DSF與Cu2+絡合后具有更強的抗CT.26WT細胞活性。藥物組與空白組相比具有顯著性差異(n=3,**為P<0.01),結果如表1和圖6所示。

圖5 DSF-NPs溶出介質的紫外光譜

表1 藥物的細胞毒性

A.5-Fu;B.DSF;C.DSF-NPs圖6 在48和72 h下5-Fu、DSF和DSF-NPs的體外抗腫瘤活性

4 討論

本文通過單因素法優化實驗條件發現,在一定比例的水和氨水情況下,實驗中所制備的二氧化硅微球粒徑存在最小值,并且隨著溫度的增大而減小。將DSF包載于低粒徑的Cu-MSNs中,能有效地改良DSF不溶于水的特性,使其能較好地分散于水溶液中,為未來應用于臨床提供了可能性,但是低粒徑的Cu-MSNs的載藥量在未來應用中仍有較大的發展空間;通過MTT法比較各濃度的給藥組之間對CT26.WT細胞的抑制作用,發現DSF-NPs的IC50值最小,說明DSF與銅離子結合后有效地提升了抗腸癌細胞的效果,銅摻雜介孔硅能為DSF提供銅離子的同時也能加速MSNs的降解,因此DSF-NPs在抗腸癌中具有優良的潛力。近年來,關于生物安全性高的介孔硅改造的研究越來越多,未來DSF-NPs在抗腸癌臨床應用中具有潛力。