基于Lactate?鄄NAD?鄄LDH模型響應面優化肉制品中亞硝酸鹽和肌紅蛋白量效關系

謝政澤 李玉涵 王琪 向杰 陳韜

摘要：為降低肉制品加工時的亞硝酸鹽添加量，在Lactate-NAD-LDH模型下采用單因素試驗和響應面設計，探究肌紅蛋白與亞硝酸鹽的量效關系，以及pH、溫度、D-異抗壞血酸鈉添加量對量效關系的影響。結果表明，pH和反應溫度對a*值、亞硝基肌紅蛋白生成量和亞硝酸鹽殘留量影響顯著，存在顯著的交互作用。亞硝基肌紅蛋白生成量最大（59.71 g/100 g）時的條件為pH 6.5、溫度50 ℃、D-異抗壞血酸鈉添加量0.07%，此時a*值為14.92，10 mg肌紅蛋白在此條件下消耗亞硝酸鹽的量為0.204 mg。此量效關系可為降低亞硝酸鹽添加量提供新思路和依據。

關鍵詞：肌紅蛋白；亞硝酸鹽；量效關系；色澤；響應面

中圖分類號：TS251.1? ? ? 文獻標志碼：A? 文章編號：1000-9973（2023）05-0017-07

Abstract： In order to reduce the addition amount of nitrite during meat product processing， single factor test and response surface design are used under Lactate-NAD-LDH model to explore the dose-effect relationship between myoglobin and nitrite， as well as the effects of pH， temperature and sodium D-isoascorbate addition amount on the dose-effect relationship. The results show that pH and reaction temperature have significant effects on a* value， nitrosomyoglobin production amount and nitrite residue amount， and there is significant interaction effect. The conditions for the maximun production of nitrosomyoglobin （59.71 g/100 g） are as follows： pH is 6.5， temperature is 50 ℃， and sodium D-isoascorbate addition amount is 0.07%. At this time， a* value is 14.92， and the consumption amount of nitrite by 10 mg myoglobin is 0.204 mg under these conditions. The dose-effect relationship can provide new ideas and basis for reducing the addition? amount of nitrite.

Key words： myoglobin; nitrite; dose-effect relationship; color; response surface

收稿日期：2022-11-19

基金項目：云南農業大學科研發展基金項目（KX900127000）

作者簡介：謝政澤（1997－），男，碩士，研究方向：畜產品加工與品質控制。

*通信作者：陳韜（1963－），男，教授，博士，研究方向：畜產品加工與品質控制。

腌臘肉制品加工時添加亞硝酸鹽具有發色[1-2]、抑菌[3-4]、抗氧化[5]、改善質構[6]等作用，同時還能使肉制品產生特殊的腌制風味[7-8]，然而亞硝酸鹽在一定條件下會生成具有致突變性和致癌性的N-亞硝基化合物[9-12]。因此，亟需尋找高效、安全降低亞硝酸鹽添加量的方法。國內外學者針對如何降低亞硝酸鹽添加量展開了相關研究，目前降低亞硝酸鹽添加量的方法主要為替代法[13]，主要的替代物質有紅曲紅色素、番茄紅素、甜菜紅[14]等天然色素[15-16]。然而替代所用的色素在光和金屬離子的作用下，大多數都具有不穩定性[17-18]，且不能產生亞硝酸鹽特有的風味[19-20]，達不到完全替代亞硝酸鹽的作用。所以，如何降低亞硝酸鹽添加量且保證亞硝酸鹽在肉制品加工中的作用成為業界十分關注的問題。

在肉制品加工中，亞硝酸鹽的添加量通常參照國標添加量和實踐經驗來確定，鮮見有人從亞硝酸鹽與肌紅蛋白的量效關系上進行研究。McClure等[21]發現，亞硝酸鹽和肌紅蛋白在有還原物質的條件下才會發生反應，所以需構建一個綜合的還原模型，以模型研究的思路來探討亞硝酸鹽和肌紅蛋白的量效關系[22]。肉中的還原反應體系除了還原酶之外，還有其他反應介質及細胞器的參與，Bekhit等[23-25]在真空包裝的鮮肉表面觀察到MetMb（高鐵肌紅蛋白）的還原，提出肉中存在天然的還原系統Lactate-NAD-LDH，該系統中包含lactate（乳酸）、NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、LDH（乳酸脫氫酶）、PMS（5-甲基吩嗪硫酸甲酯）等物質。

本研究運用單因素試驗與響應面設計在Lactate-NAD-LDH模型下探究肌紅蛋白和亞硝酸鹽的量效關系以及pH、溫度、D-異抗壞血酸鈉添加量的變化對體系a*值、亞硝基肌紅蛋白（NOMb）生成量和亞硝酸鹽殘留量的影響，優化了最佳反應條件，以期為肉制品生產加工過程中降低亞硝酸鹽添加量提供思路及依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肌紅蛋白（純度＞95%）、NAD、亞硝酸鹽含量檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；D-異抗壞血酸鈉：盛達食品有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑有限公司；乳酸鈉：羅恩試劑；LDH、PMS：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

R-Biopharm EL1酶標儀 Thermo Scientific公司；CR-400色差儀 日本美能達公司；HH-8水浴鍋 金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；HC-3018R臺式高速冷凍離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；HJ-3磁力攪拌器 江蘇金壇醫療儀器廠；HI9025C便攜式pH計 意大利哈納（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 亞硝酸鹽最適添加量確定試驗

Lactate-NAD-LDH模型參考McClure等[21]的方法建立，稍有修改。首先將肌紅蛋白溶解在30 mmol/L磷酸緩沖液中，然后分別將乳酸鈉（20 mmol/L）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（0.65 mmol/L）、乳酸脫氫酶（0.04 unit）、PMS（0.75 mmol/L）、亞硝酸鹽加入溶液中，最后調節模型的pH至7.2，試驗在室溫（23 ℃）下進行。根據亞硝酸鹽和肌紅蛋白的化學反應，1 mg肌紅蛋白需要0.006 1 mg亞硝酸鹽，因原模型NOMb生成量較小，不方便測量，所以將Lactate-NAD-LDH模型中肌紅蛋白的量增加到10 mg。為了讓加入的肌紅蛋白最大程度地參與反應，模型中亞硝酸鹽的添加量設置為0.0，0.2，0.3，0.4 mg。在反應后于1，4，7，12 h分別測定亞硝酸鹽殘留量和NOMb生成量以確定最大添加量。

1.3.2 單因素試驗

在Lactate-NAD-LDH模型下，考察模型pH、反應溫度、D-異抗壞血酸鈉添加量的變化對a*值和NOMb生成量的影響。通過預試驗發現，模型a*值和NOMb生成量在反應開始的1 h內快速升高，達到最大值，反應1 h后下降，在后續反應時間內無明顯變化，所以將反應時間設置為1 h、亞硝酸鹽添加量設置為0.4 mg進行單因素試驗，并確定響應面試驗中各因素的最適考察范圍。反應條件如下：

考察pH為5.0，5.5，6.0，6.5，反應溫度為42 ℃，D-異抗壞血酸鈉添加量為0.06%；考察D-異抗壞血酸鈉添加量為0.05%、0.06%、0.07%、0.08%，反應溫度為42 ℃，pH為5.5；考察反應溫度為42，46，50，54 ℃，pH為5.5，D-異壞血酸鈉添加量為0.06%。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，以反應溫度、pH、D-異抗壞血酸鈉添加量為因素，以a*值、NOMb生成量、亞硝酸鹽殘留量為評價指標，設計三因素三水平響應面試驗。響應面試驗因素水平見表1。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 亞硝酸鹽殘留量的測定

使用北京索萊寶科技有限公司提供的亞硝酸鹽含量檢測試劑盒進行反應體系中亞硝酸鹽殘留量測定。

1.3.4.2 NOMb生成量的測定

參考Eyiler等[15]的方法，略有修改。反應溶液為80%丙酮和20%水，料液比1∶4，5 000×g離心5 min，取上清液測定吸光度。

總血紅素（mg/kg）=A640×680，

NOMb（mg/kg）=A540×290，

NOMb生成量（g/100 g）=NOMb（mg/kg）總血紅素（mg/kg）×100。

1.3.4.3 色澤的測定

反應體系色澤用便攜式色差儀（Minolta Cameras CR-400，Japan）測量，將色差儀探頭對準反應體系表面，記錄反應體系的a*值，儀器使用前用標準板校正。重復測定3次取平均值。

1.4 統計分析

所有試驗重復3次。采用SPSS Statistics 25對單因素試驗結果進行方差分析和多重比較，響應面設計與分析采用Design Expert 8.0.6，采用GraphPad Prism 8.3.0軟件繪圖。結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽添加量對亞硝酸鹽殘留量、NOMb生成量的影響

由圖1中A可知，隨著反應時間的延長，所有組亞硝酸鹽殘留量均逐步降低，隨著亞硝酸鹽添加量的增加，反應體系中亞硝酸鹽殘留量也隨之增加（P＜0.05）。各添加量組NOMb生成量見圖1中B，添加0.2 mg 亞硝酸鹽組的 NOMb生成量一直處于上升狀態，在12 h時達到最大。添加0.3，0.4 mg 亞硝酸鹽組，在7 h內NOMb生成量無明顯變化，7 h后急劇上升，在12 h時達到最大。在反應7 h內亞硝酸鹽添加量為0.2 mg組的NOMb生成量顯著高于亞硝酸鹽添加量為0.3，0.4 mg組，原因可能是當亞硝酸鹽添加量大于0.2 mg時，在反應7 h內肌紅蛋白會被亞硝酸鹽氧化[26]，從而生成NOMb（Fe3+），7 h后在Lactate-NAD-LDH模型中NOMb（Fe3+）被還原，導致NOMb（Fe2+）的生成[27]。在12 h時未添加亞硝酸鹽組的NOMb生成量顯著低于添加亞硝酸鹽組（P＜0.05），添加亞硝酸鹽的組間NOMb生成量差異不顯著（P＞0.05），考慮到后續試驗有加熱處理，且加熱會導致亞硝酸鹽分解，故選0.4 mg為后續試驗亞硝酸鹽添加量。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同反應溫度對亞硝酸鹽殘留量、NOMb生成量和a*值的影響

由圖2中A可知，在各反應溫度下，NOMb生成量隨溫度的升高呈現先增加后減少的趨勢。50 ℃組的NOMb生成量最大（P＜0.05），這可能是由于該溫度下亞硝酸鹽分解增加[28]，產生了更多的NO，NO與Mb結合生成較多的NOMb[29]，與此對應的是該組的亞硝酸鹽殘留量（0.231 mg）顯著低于其他試驗組（P＜0.05）。有研究發現，50 ℃左右時乳酸脫氫酶的活性比較高，所以產生的還原物質會隨之增加[30-31]，亞硝酸鹽被還原，產生的NO也會隨之增加，導致亞硝酸鹽殘留量下降。不同反應溫度下的a*值見圖2中B，50 ℃反應組的a*值顯著高于其他溫度組（P＜0.05），這與NOMb生成量結果一致。綜合所有因素考慮，響應面優化試驗溫度選擇46，50，54 ℃。

2.2.2 不同反應pH對亞硝酸鹽殘留量、NOMb生成量和a*值的影響

由圖3中A可知，在不同pH條件下，NOMb生成量隨pH的升高而增加，pH為6.5時NOMb的生成量達到最大值（P＜0.05），這可能與氧合肌紅蛋白在不同pH條件下的存在狀態有關。據劉越[32]報道，肌紅蛋白在偏堿性條件下較穩定，酸性條件和極堿性條件都會促進肌紅蛋白的氧化，pH越低，氧化速率越快。亞硝酸鹽的殘留量隨pH的升高而降低，說明亞硝酸鹽的還原速率與pH呈正相關，這可能與乳酸脫氫酶在不同pH環境下的活性有關[33-34]。NOMb生成量達到最大時，亞硝酸鹽的殘留量為0.235 mg。pH與a*值的關系見圖3中B，反應體系的a*值隨pH的升高而逐步升高，在pH為6.5時達到最大，且各pH組之間的差異顯著（P＜0.05）。考慮到加工肉制品的pH一般在5.0～6.5左右，響應面優化試驗pH選擇5.5，6.0，6.5。

2.2.3 不同D-異抗壞血酸鈉添加量對亞硝酸鹽殘留量、NOMb生成量和a*值的影響

由圖4可知，隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，NOMb生成量和a*值差異均不顯著（P＞0.05），但添加量為0.07%組的NOMb生成量和a*值較高，此時亞硝酸鹽殘留量為0.270 mg。綜合所有因素考慮，響應面優化試驗D-異抗壞血酸鈉添加量選擇0.06%、0.07%、0.08%。

2.3 響應面試驗

響應面試驗設計及結果見表2，根據響應面設計方案，對其進行方差分析，回歸模型方差分析見表3～表5。

由表3～表5可知，NOMb生成量和a*值模型達到極顯著程度（P<0.000 1），亞硝酸鹽殘留量模型達到較顯著程度（P＜0.01），3個模型失擬項的P＞0.05，意味著失擬項對于純誤差不顯著，決定系數分別為0.992 6，0.986 4，0.963 5，說明該模型擬合程度良好，誤差較小，該回歸方程能很好地描述各因素與響應值之間的關系。反應溫度（A）對NOMb生成量和a*值影響顯著，對亞硝酸鹽殘留量影響較顯著；pH值（B）對NOMb生成量、a*值和亞硝酸鹽殘留量影響極顯著；D-異抗壞血酸鈉添加量（C）對NOMb生成量影響顯著，對a*值和亞硝酸鹽殘留量影響不顯著。交互項AB對NOMb生成量和亞硝酸鹽殘留量影響較顯著，對a*值影響顯著，AC、BC影響均不顯著。

2.4 響應面圖分析

pH和反應溫度的交互作用對a*值、NOMb生成量和亞硝酸鹽殘留量影響的響應面見圖5。

由圖5可知，隨著反應溫度的升高，a*值、NOMb生成量、亞硝酸鹽殘留量呈現先升高后下降的趨勢。而隨著pH的升高，a*值和NOMb生成量均呈現升高趨勢，亞硝酸鹽殘留量呈現下降趨勢。響應面坡度較陡，說明反應溫度和pH之間交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

利用Design Expert 8.0.6軟件對響應面優化試驗結果進行回歸方程擬合，得到二階回歸方程分別如下：

a*值=12.05+0.35A+3.51B+0.33C-0.75AB+0.34AC－0.12BC－2.12A2－0.47B2－0.72C2。

NOMb生成量=48.30+1.82A+14.27B－0.18C－3.09AB+0.16AC+0.27BC－7.11A2－2.26B2－1.23C2。

亞硝酸鹽殘留量=0.23－4.000E－003A－7.625E－003B+1.250E－004C+3.750E－003AB+1.250E－003AC+1.000E－003BC+4.500E－003A2－2.750E－003B2+1.750E－003C2。

當NOMb生成量和a*值最大時，模型的最佳優化工藝為：反應pH為6.5，反應溫度為50 ℃，D-異抗壞血酸鈉的添加量為0.07%，此時的NOMb生成量、a*值和亞硝酸鹽殘留量分別為59.836 g/100 g，14.99和0.219 mg。

2.5 驗證試驗

將優化出來的反應條件應用到模型中進行驗證，設定反應pH為6.5，反應溫度為50 ℃，D-異抗壞血酸鈉添加量為0.07%，進行3次平行試驗，實測a*值、NOMb生成量和亞硝酸鹽殘留量分別為14.92，59.705 g/100 g和0.204 mg，分別達到預測值的99.5%、99.7%、93.15%。說明該模型可以較好地解釋pH、反應溫度、D-異抗壞血酸鈉添加量和a*值、NOMb生成量、亞硝酸鹽殘留量之間的關系。

3 結論

在Lactate-NAD-LDH模型下，反應溫度和pH值對NOMb生成量、a*值和亞硝酸鹽殘留量的影響顯著；D-異抗壞血酸鈉添加量對NOMb生成量的影響顯著，對a*值和亞硝酸鹽殘留量的影響不顯著；反應溫度和pH值對NOMb生成量、a*值和亞硝酸鹽殘留量有顯著交互作用。a*值和亞硝基肌紅蛋白生成量最大的反應條件為反應溫度為50 ℃、pH為6.5、D-異抗壞血酸鈉添加量0.07%，此時的a*值為14.92，NOMb生成量為59.705 g/100 g，10 mg肌紅蛋白在此條件下所消耗的亞硝酸鹽的量為0.204 mg。該結果可為肉制品加工時降低亞硝酸鹽添加量提供一定的理論依據。

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