黃鱔細胞質動力蛋白3基因的克隆及其在性逆轉中的功能分析

連子童，夏雪平，李 忠，田海峰，蔣欽楊，胡喬木

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

黃鱔(Monopterusalbus)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes)輻鰭亞綱(Actinopteryii)合鰓目(Synbranchiformes)合鰓亞目(Synaphobranchoidei)合鰓科(Synbranchidae)黃鱔屬(Monopterus)，屬于溫熱帶淡水魚類，廣泛分布于亞洲東部和南部，在國內盛產于長江流域的湖北、江西、湖南和四川等地[1]。黃鱔為先雌后雄型雌雄同體魚類，在性腺發育中存在性逆轉現象[2-4]，第一次產卵后，卵巢結構逐漸退化精巢結構逐漸出現[5]。原始精原細胞開始發育形成精小囊，此時性腺內存在未退化卵巢結構與發育階段精巢結構，該發育時期為間性發育階段[6-8]。近年來隨著黃鱔人工繁育技術的突破，解決了以捕捉野生苗種進行養殖的問題，穩定優質的種苗輸出使黃鱔成為長江流域重要的養殖特優水產品之一。由于黃鱔養殖產業的逐步發展壯大，對其親本的培育顯得尤為重要。在集約化養殖中，2年齡黃鱔作為母本，每尾平均懷卵約800枚，產卵后發生性逆轉，在一定程度上限制了黃鱔產卵量。對黃鱔性逆轉基因的研究，解析性逆轉機制，為培育不發生性逆轉的雌鱔奠定基礎。

細胞質動力蛋白是一種微管運動蛋白，包括兩類：dynein-1和dynein-2，dynein-1是一種蛋白復合物，參與有絲分裂過程中的膜運輸、細胞器動力學和染色體分離過程[9]，dynein-1包括2條重鏈、2～3條中間鏈、兩個輕中間鏈以及一些輕鏈亞基，包括dynein輕鏈(dynll1)，roadblock(dynlrb1和dynlrb2)和Tctex家族(dynlt1，dynlt3)[10]。dynlt3與性腺發育及多種功能有關，包括有絲分裂、精子運動、染色體分離及mRNA胞內運輸等[11]。近期研究表明，dynlt3具有組織表達特異性[12]，DIBELLA等[13]對dynlt3在哺乳動物減數分裂中作用研究時發現，dynlt3在卵母細胞減數分裂過程中染色體對齊和同源染色體分離發揮重要作用。

動力蛋白輕鏈Tctex-type 3(dynlt3)基因最初在T單倍型的小鼠睪丸中發現[14-15]，dynlt3在精子尾部鞭毛動力蛋白和胞質動力蛋白中均有存在[16-17]。dynlt3在染色體分離過程中具有重要作用，人類細胞有絲分裂過程中，dynlt3參與染色體聚集過程；小鼠卵母細胞減數分裂過程中，染色體對齊過程同樣需要dynlt3參與。KING等[18]使用靶向破壞，在小鼠中滅活了dynlt3基因，缺陷型雄鼠表現出精子發生異常、精子活力下降、由子宮進入輸卵管的能力下降，推測dynlt3基因可能在雄性性腺發育及精子發生中發揮重要作用。

本實驗以雌、雄、間性發育黃鱔為研究對象，分析不同組織、不同發育時期性腺、甲基睪丸酮處理性腺及Zebularine處理性腺原代細胞后dynlt3基因表達模式變化，為黃鱔性逆轉機制解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃鱔取自湖北省仙桃市忠善黃鱔苗種繁育專業合作社，取樣前饑餓處理24 h，麻醉劑MS-222(500 mg/L，5 min)麻醉實驗黃鱔，分別采集雌、間、雄性黃鱔性腺各3組，每組3～4尾。采集肝、脾、腸、腦、肌肉、皮膚、腎臟、心臟組織于RNAstore Reagent中，每組采集1齡黃鱔3～4尾，用于RNA提取。

60日齡黃鱔幼苗100尾隨機分為四組，在室溫下分別飼養于(230 mm×165 mm×80 mm)水箱中，水箱中注水量為2 000 mL，每日換水兩次并投喂紅蟲漿餌料。甲基睪酮(methyltestosterone，MT)經無水乙醇溶解至500、1 000、1 500 mg/L，每次換水后添加400 μL MT至終濃度為100、200、300 μg/L，處理2個月。取樣前暫停處理24 h，MS-222(500 mg/L)麻醉處理5 min后采集性腺，性腺樣品分為兩份，一份保存于4%多聚甲醛(pH 7.5)用于制作組織切片，另一份保存于RNAstore Reagent用于RNA提取。

1.2 生物信息學分析

將擴增得到的dynlt3基因cDNA片段測序驗證，在NCBI數據庫中在線軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi；www.ncbi.nlm.nih.gov/structure)預測開放閱讀框和保守區。利用在線工具ProtParam(https：//www.expasy.org/resources/protparam)對黃鱔DYNLT3蛋白進行理化性質預測；利用在線工具PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/SMART)分析DYNLT3的蛋白二級結構；利用在線工具SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)預測DYNLT3蛋白三級結構；利用MEGA 7.0軟件采用NJ法(neighbor-joining method)構建黃鱔與其它物種的DYNLT3氨基酸系統進化樹。使用在線工具WebLogo3、MEME(http：//weblogo.threeplusone.com/；https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)預測氨基酸保守序列，比對黃鱔與其它脊椎動物的DYNLT3氨基酸序列進行同源性分析。

1.3 總RNA提取與反轉錄

取40 mg組織于PBS中沖洗，剪碎組織樣品，按TRIzol Reagent說明書提取總RNA，并檢測RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。按反轉錄試劑盒(TaKaRa)說明書，對總RNA進行反轉錄，反轉錄后的cDNA于-20 ℃保存備用。

1.4 Zebularine處理原代性腺細胞

收集1齡左右黃鱔卵巢組織，用PBS(含10%雙抗)沖洗性腺。將性腺剪碎，至組織塊大小為1～2 mm3左右，將處理后的組織塊用70目細胞篩過篩處理為原代單細胞。將原代單細胞懸液隨機分置四組，于6孔細胞培養板中培養，加入完全培養基(10%雙抗，10%胎牛血清，DMEM高糖培養基)27 ℃貼壁6～12 h。將Zebularine用DMSO稀釋至100 μmol/L，實驗組分別加入50、100、200 mg Zebularine稀釋液，對照組加入10 μL DMSO，27 ℃孵育12 h，收集原代細胞。用細胞、組織RNA柱式提取試劑盒(諾唯贊)提取細胞RNA。

1.5 實時熒光定量PCR

選EF-1α作內參基因，cDNA作模板，每組3個重復。遵照2×T5 Fast qPCR Mix的使用說明，配成10 μL反應體系。反應在Quant Studio 5實時定量PCR系統上進行，2-△△CT法計算相對表達量；所得數據在統計軟件SPSS 22.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan′s法多重比較分析。

1.6 切片原位雜交

設計引物(表1)以cDNA為模板通過PCR技術對探針片段進行擴增，按膠回收試劑盒(TaKaRa)說明書，對擴增產物進行膠回收，檢測RNA完整性與濃度，通過T7體外轉錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific)制備探針。

表1 引物序列Tab.1 primers sequences

雌、間、雄性黃鱔性腺切片各兩組，使用二甲苯、各濃度梯度乙醇溶液對切片進行脫蠟處理；對脫蠟后的切片進行4% PFA-PBS固定、HCl處理、10 μg/mL蛋白酶K消化處理。加入預雜交液(含tRNA、肝素)，70 ℃預雜交2～5 h；加入預雜交液(含反義RNA探針100～200 ng)，70 ℃過夜；50%預雜交液(無tRNA和肝素)，50% 2×SSC，70 ℃，15 min；0.2×SSC，70 ℃，2×30 min；1×MAB(100 mmol/L馬來酸，150 mmol/L NaCl，pH 7.5)室溫5 min。室溫用Blocking Buffer(10%山羊血清，2% BMB，1×MAB)封閉4 h。抗體雜交：加Blocking Buffer 500倍稀釋的抗體(Roche Applied Science，Germany)，4 ℃過夜，PBST室溫沖洗樣品。按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天)說明書進行顯色處理；顯色理想后PBS沖洗終止顯色。

2 結果與分析

2.1 黃鱔dynlt3基因序列分析

采用RT-PCR和RACE技術，克隆獲得dynlt3全長1 082 bp，5′UTR 119 bp，3′UTR 609 bp，開放閱讀框354 bp，編碼117 aa(圖1A)。利用在線工具ProtParam對黃鱔DYNLT3蛋白進行理化性質預測，結果顯示DYNLT3分子式為C656H1011N177O216S11，相對分子質量為15 169，理論等電點為4.53，在哺乳動物網狀細胞、酵母以及大腸桿菌體內的半衰期分別為30 h、>20 h、>10 h，不穩定系數為39.81，脂肪系數為71.82，總平均親水性為-0.253，屬于不穩定親水蛋白。利用在線工具CD-Search分析DYNLT3蛋白在第23至第114位氨基酸區域為動力蛋白輕鏈(DLC)類域超家族保守域[dynein light chain(DLC)-like domain superfamily，cl41776]，利用在線工具SWISS-MODEL預測DLC蛋白的三級結構(圖1A)。

圖1 黃鱔dynlt3基因cDNA序列與氨基酸序列及其蛋白結構域分析與三級結構預測Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of dynlt3 gene in M.albus；DYNLT3 protein domain analysis and tertiary structure prediction of M.albusA：dynlt3基因cDNA序列與推導的氨基酸序列。黃線代表5′UTR與3′UTR區域，紫色區域為其編碼的氨基酸序列；B：黃鱔DYNLT3蛋白二級結構示意圖；C、D：DYNLT3蛋白3D視圖。

PSIPRED在線工具預測結果顯示蛋白的二級結構包含37.96%的α-螺旋，29.20%的β-折疊，32.85%的無規則卷曲(圖1B)，利用在線工具SWISS-MODEL通過同源建模法預測DYNLT3蛋白的三級結構(圖1C、D)，GMQE估計分數為0.56(在0到1之間)表明預測三級結構模型準確性較高，可以作為DYNLT3蛋白結構模型參考；QMEAN估計分值為-3.56(在0～4之間)表明該模型結構具有良好的一致性，一致度達到54.63%即模型的準確度可以達到95%以上，參考性較高。

2.2 黃鱔DYNLT3氨基酸序列比對與進化樹分析

使用在線工具WebLogo3對DYNLT3氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進行對比預測氨基酸保守序列，DYNLT3相對保守，其編碼蛋白序列在第32-114 aa存在保守區域，與在線工具CD-Search分析相同(圖2A)。利用在線工具MEME比對黃鱔與其它脊椎動物DYNLT3氨基酸序列同源性分析，得出排名前三氨基酸序列及其所在氨基酸序列相對位置，且該結構域在黃鱔與其它脊椎動物的氨基酸序列中僅存在幾個氨基酸的差異(圖2B、C)。

圖2 DYNLT3氨基酸序列多重比較及其保守序列及氨基酸序列相對位置Fig.2 Multiple comparison of DYNLT3 amino acid sequences；The conserved amino acid sequence of DYNLT3 and its relative position in the amino acid sequence

在黃鱔DYNLT3氨基酸序列與GenBank中已知物種的氨基酸序列進行比對分析基礎上，使用MEGA 7.0軟件構建黃鱔與其他物種間分子系統進化樹，結果顯示黃鱔與底鳉(Fundulusheteroclitus)、鯉(Cyprinuscarpio)、鯽(Carassiusauratus)等聚為一大支；哺乳類、鳥類和爬行類聚為一支；兩棲類聚為獨立一支(圖3)。且黃鱔DYNLT3氨基酸序列與底鳉親緣關系最近，該結果符合物種一般進化規律。

圖3 基于黃鱔與不同物種DYNLT3氨基酸序列的NJ進化樹分析Fig.3 NJ phylogenetic tree analysis based on DYNLT3 amino acid sequences of M.albus and different species

2.3 黃鱔dynlt3基因組織表達分析

通過RT-PCR對黃鱔dynlt3基因進行不同組織的表達分析，結果顯示dynlt3在黃鱔肌肉和腦具有較高表達，心臟次之，在皮膚、脾臟、腎臟以及胃中表達中等，在腸、肝和卵巢有較低表達且差異顯著(圖4A)；dynlt3基因在黃鱔性腺不同發育階段表達結果顯示，dynlt3在雌性卵巢至間性早期黃鱔性腺中表達量無顯著性差異，間性后期與雄性睪丸中表達量無顯著性差異，但顯著高于卵巢與間性早期表達量(圖4B)。

圖4 dynlt3基因在黃鱔不同組織、不同性腺發育時期中的表達Fig.4 Expression of dynlt3 gene at different gonad development stages in different tissues of M.albus圖中不同字母表示各組織之間差異顯著(P<0.05)；Sk：皮；He：心；In：腸；Mu：肌肉；Li：肝；Sp：脾；Ki：腎；Ov：卵巢；Br：腦；St：胃。

2.4 黃鱔dynlt3基因組織表達定位

通過原位雜交技術對黃鱔卵巢、間性性腺、精巢細胞中dynlt3的表達定位分析。結果顯示使用正義RNA探針雜交性腺中未檢測到dynlt3的陽性信號(圖5A)，使用反義RNA探針原位雜交的性腺中可檢測到藍紫色陽性信號。在II時期卵巢中dynlt3基因主要在卵母細胞細胞質中表達(圖5B)；間性性腺組織中dynlt3基因主要在精原細胞和初級精母細胞中表達(圖5C)；精巢組織中可在精原細胞與初級精母細胞中檢測到dynlt3基因表達(圖5D)。

圖5 黃鱔dynlt3基因在不同發育階段性腺中的表達定位Fig.5 The expression and location of dynlt3 in gonads at different developmental stagesA：對照組；B：卵巢；C：間性發育時期；D：精巢；Ch：染色質；FM：濾泡膜；N：細胞核；Nu：核仁；Oo II：II時相卵母細胞；Oo III：III時相卵母細胞；PSG：初級精母細胞；SG：精原細胞；Va：液泡；YG：卵黃顆粒；YM：卵黃塊；Yp：卵黃小板。

2.5 MT處理后卵巢結構變化及Zebularine處理原代性腺細胞dynlt3表達模式分析

將2月齡黃鱔采用MT處理2個月后，HE切片結合顯微鏡觀察，結果表明經MT處理后卵巢組織結構發生明顯退化，主要表現為II時相卵母細胞退化且數量減少，卵膜與卵質明顯分離，卵巢結締組織間出現空泡結構(圖6A)。MT處理2月后，退化卵巢中dynlt3基因的表達量降低，且與對照組表達量存在顯著差異(圖6B)。

取1齡黃鱔卵巢，將性腺組織處理為單細胞，進行原代性腺細胞培養。向培養基中添加Zebularine進行去甲基化處理后，dynlt3基因在不同濃度梯度Zebularine處理原代細胞中表達無顯著性差異(圖6C)。

3 討論

本研究成功克隆了dynlt3基因，全長1 082 bp，5′UTR 119 bp，3′UTR 609 bp，開放閱讀框354 bp，編碼117 aa。通過在線工具SMART分析黃鱔DYNLT3蛋白序列比對結果顯示，DYNLT3蛋白在第32至第114位氨基酸區域為動力蛋白輕鏈(DLC)類域超家族保守域，在不同的家族成員之間具有高度的同源性。dynein輕鏈(DLC)-like結構域超家族是一類含有DLC結構域的蛋白質，該結構域具有反向平行的β-折疊與α-螺旋。含有DLC類結構域的蛋白包括細胞質dynein輕鏈DYNLL1和DYNLL2、動力蛋白輕鏈Tctex型DYNLT1和DYNLT3[10]等。

在魚類的性別發育過程中存在天然的性逆轉現象，黃鱔具有典型的“首雌特征”即先為雌性卵巢，卵巢發育完全后逆轉為雄性精巢。目前對于黃鱔性逆轉過程中差異表達基因的研究主要在呈現出性別二態性的基因，如cypl9a、foxl2、gdf9等基因。對于性逆轉過程中其他差異表達基因研究較少。本研究從黃鱔卵巢、間性性腺、精巢轉錄組測序中獲的差異表達基因dynlt3。檢測dynlt3基因在不同組織中mRNA的表達情況，結果顯示該基因在多個組織器官中都有表達，其中肌肉和腦中的表達量最高，腸、肝和卵巢中表達量較低。

通過對比不同性腺發育時期表達量結果顯示，dynlt3基因在雌性發育時期與間性發育早期表達量較低，隨著性腺逐漸向雄性性腺發育，基因表達量逐漸增加。RASHID等[19]對患弱精子癥小鼠dynlt3表達水平研究表明，dynlt3表達水平與精子活力和形態呈顯著正相關，dynlt3基因可能影響鞭毛的結構和功能。LI等[20]對差異表達的蛋白DYNLT1在精子細胞發育和鞭毛組裝等階段進行特異性富集分析，結果表明DYNLT1在精子尾部發育中發揮重要作用[20]。在間性后期與雄性發育時期黃鱔性腺中初級精母細胞開始逐漸發育為次級精母細胞和精子[21]，因此，精巢中dynlt3基因表達水平是由精巢發育水平影響，綜上推測dynlt3基因在性逆轉過程及精子發育過程中發揮重要的作用。

甲基睪酮為天然雄激素睪酮的17-α位甲基衍生物，具有抗雌激素作用，抑制卵巢功能及子宮內膜生長。將MT添加到幼鯢飼料中可使雄性大鯢比例顯著升高，表明飼喂添加性激素類似物可顯著增加幼鯢發生性反轉比例[22]。在使用性激素處理黃鱔實驗中，注射MT未得到具有生殖能力的性逆轉雄魚，但MT可促進雌鱔卵母細胞退化[23]。本研究通過在水體中添加甲基睪酮抑制卵巢功能及性腺細胞發育，由HE染色結果可知，MT處理導致黃鱔生殖板周圍形成大面積中空，生殖板出現明顯增粗延長毛細血管豐富，且組織中出現卵膜與卵質分離現象。上述現象表明，MT處理可能促進卵巢退化，且生殖板周圍出現中空小葉，但未見卵巢排卵，說明生殖板周圍出現的中空是由于MT處理作用下雌性組織中II時相卵母細胞退化及雄性發育進程加速導致的。該結果與黃鱔外源性甲基睪酮實驗結果相同[23]，dynlt3基因在性腺組織中的表達相較于對照組呈顯著性下降(P<0.05)，推測該基因表達水平下降是由于MT處理使卵母細胞早期發育抑制引起的，綜上所述，dynlt3基因在卵母細胞早期發育中發揮重要生物作用。

RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學或RNA原位雜交。該技術可在性腺組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測組織中相應的基因片段相結合。通過原位雜交來對卵巢組織、間性性腺組織、精巢組織細胞中dynlt3基因的表達進行定位，結果顯示在三組性腺組織中均存在陽性表達。在雌性組織中dynlt3基因主要在Ⅱ時相卵母細胞細胞質中表達，同時期對照組中未見陽性表達；在間性性腺中dynlt3基因主要在精原細胞和初級精母細胞中表達；雄性組織中dynlt3基因在初級精母細胞及次級精母細胞中表達明顯。

Zebularine是一種DNA甲基化(DNA methylation)抑制劑，其作用機制可能是與DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases)形成致密共價復合物阻止了Dnmt的釋放，從而使DNA達到去甲基化狀態[24-25]。本研究中通過對原代性腺細胞使用Zebularine處理，降低原代性腺細胞甲基化水平，對dynlt3基因表達模式進行分析。研究發現經Zebularine處理，dynlt3基因表達未呈現顯著性差異，因此無法判斷甲基化是否在dynlt3基因表達過程中的作用，甲基化修飾在dynlt3基因表達過程中發揮的作用還有待研究確定。