鰻鱺圓環病毒SYBR Green I qPCR檢測方法的建立與應用

林而舒

(福建省淡水水產研究所，福州 350000)

鰻鱺(Anguillaapp.)是我國淡水養殖的重要經濟品種，因其具有營養豐富、肉質鮮美等特點，深受消費者喜愛[1]。但是隨著集約化養殖模式的不斷發展，鰻鱺養殖過程中的病害種類越來越多，危害也日趨嚴重。其中以鰻鱺病毒性疾病危害特別嚴重，具有發病急、病程短和死亡率高等特點，給養鰻業帶來了巨大的經濟損失[2]。鰻鱺病毒性病原主要包括：鰻鱺皰疹病毒(Anguillidherpesvirus)[3]、鰻鱺圓環病毒(Eelcircovirus，EeCV)[4]、鰻鱺雙RNA病毒(Eelviruseuropean)[5]等。

EeCV是引起鰻鱺圓環病毒病的主要病原，患病病鰻呈現紅頭、爛鰓后“開窗”、喉部囊腫等癥狀。EeCV為小型的、裸露的環狀單鏈DNA病毒，其結構為二十面體病毒粒子，直徑大小為12～26 nm，衣殼僅由1種結構蛋白(衣殼蛋白)組成。EeCV基因組大小在1.7～2.3 kb之間[6，7]，有一個雙義的基因組，包含兩個主要的開放閱讀框(ORF)，以相反的方向排列，編碼復制啟動蛋白和衣殼蛋白。在主要ORF的5′端之間有一個非常保守的莖環結構位，在病毒復制中起著重要作用[7]。在過去的研究中，只有禽類和豬被認為是圓環病毒的常見宿主，但近幾年隨著檢測技術的不斷進步，發現圓環病毒的脊椎動物宿主譜已經擴大至魚類和兩棲動物[8-11]。

國內外關于EeCV的研究均處于起步階段[12，13]，關于EeCV檢測方法的報道則更少，李苗苗[4]在2018年報道過EeCV PCR檢測方法的建立與應用，BORZK等[12]利用巢式PCR技術對EeCV進行檢測。本研究設計了多對qPCR引物，篩選出一對能夠高效且特異擴增EeCV復制相關蛋白基因(replication-associated protein，RAP)部分序列的引物，基于該基因序列建立了EeCV SYBR Green I qPCR檢測方法，以期為準確、快速地定量檢測鰻鱺圓環病毒提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

具有鰻鱺圓環病毒病典型特征的患病魚取自福建省大田、邵武、福清、光澤和江西武寧、吉安等地區的鰻鱺養殖場。將病鰻裝在塑料袋中充氧，2～3 h內運達實驗室，迅速活殺，取病魚的血液、粘液、鰓、心、肝、脾、腸、腎組織等保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion2.0plus dye)試劑盒、TBGreen?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒和質粒抽提試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；海洋動物基因組DNA提取試劑盒、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；ONE-4-ALL基因組DNA小量提取試劑盒和MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix試劑盒購于BBI生命科學有限公司；pUCm-T載體PCR產物快速連接試劑盒、DNA Marker、DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。豬圓環病毒(Porcinecircovirus)FN毒株DNA由福建農林大學動科院饋贈，鴨圓環病毒(Duckcircovirus)FJ毒株DNA由福建省農科院饋贈，鰻鱺皰疹病毒(Anguillidherpesvirus)AnHV毒株DNA和羅非魚湖病毒(Tilapia lake virus)TiLV毒株RNA由福建省水產技術推廣總站饋贈，維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)和鰻鱺(Anguillajaponica)基因組由實驗室自行分離提取，-80 ℃保存。

1.3 主要儀器

普通PCR儀(T100TMThermal Cycler，BIO-RAD)、qPCR儀(7500 Real Time PCR System，ABI)、超微量紫外可見分光光度計(BioDrop μlite+，BioDrop)、凝膠成像分析系統(Gel DocTM XR+，BIO-RAD)等。

1.4 引物設計與合成

根據GenBank中鰻鱺圓環病毒參考株(KU951579.1)的基因組序列設計特異性擴增RAP序列的普通PCR引物對RAP-F/R，并在此基礎上設計優選SYBR Green I qPCR引物對qF/R(表1)。Lmm-F/R參考文獻[4]。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1.5 質粒標準品的制備

取肝、腎、脾和鰓等混合組織病料20 mg，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。用引物RAP-F/RAP-R對總DNA進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。回收純化目的片段后，由上海生工公司進行測序驗證。

將目的片段克隆至pUCm-T載體，用質粒抽提試劑盒提取質粒DNA后，進行測序鑒定，獲得質粒pUCm-T-RAP，于-80 ℃保存備用；用超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度，并計算單位體積(μL)DNA樣品中質粒的拷貝數，計算方式參考文獻[2]。

1.6 qPCR檢測方法的建立

1.6.1 建立標準曲線

10倍比稀釋質粒pUCm-T-RAP DNA至1.0×108～100個拷貝數/μL作為模板，共計9個濃度梯度。使用TBGreen?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行qPCR擴增，引物為qF/qR，每個濃度設置3個重復，陰性對照用ddH2O代替模板，制作標準曲線。qPCR反應體系總量為20 μL：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Dye II 0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

1.6.2 靈敏性檢測

將pUCm-T-RAP質粒DNA梯度稀釋作為模板，分別進行qPCR和普通PCR擴增，qPCR方法使用的引物為qF/qR，普通PCR法使用的引物為Lmm-F/R，以便分析2種方法所能檢測的最低EeCV拷貝數。

普通PCR反應體系總量為20 μL：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃再延伸10 min。

1.6.3 特異性檢測

將鰻鱺皰疹病毒、豬圓環病毒、鴨圓環病毒、羅非魚湖病毒、鰻鱺、遲鈍愛德華菌和維氏氣單胞菌的基因組作為模板進行qPCR擴增，評價檢測方法的特異性。其中羅非魚魚湖病毒為RNA病毒，需將RNA反轉錄為cDNA再進行qPCR，反轉錄體系總量為20 μL：2×Mix 10 μL，模板6 μL，ddH2O 4 μL；反轉錄程序為：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.6.4 重復性檢測

取1.0×106、1.0×105、1.0×104個拷貝數/μL的pUCm-T-RAP質粒DNA和臨床樣品作為模板進行qPCR擴增，每個濃度設3個重復，根據閾值循環數(Cycle threshold value，Ct值)的變異系數分析該方法的組內重復性；實驗重復3次，分析組間重復性。

1.7 qPCR檢測方法在臨床樣品的應用

選取8尾患圓環病毒病的美洲鰻鱺，分別收集其皮膚黏液、鰭、鰓、肝臟、腎臟、脾臟、腸道和心臟等重要組織，用海洋動物基因組DNA提取試劑盒總DNA作為模板，用建立的qPCR方法分別檢測不同病鰻不同組織部位的圓環病毒載量，分析病毒在不同組織的分布狀況。實驗數據使用Excel進行統計和整理，用DPS數據處理系統進行差異顯著性分析。

用建立的qPCR方法和普通PCR法對44份疑似感染鰻鱺圓環病毒的鰻鱺組織樣品進行檢測。qPCR方法使用的引物為qF/qR，普通PCR法使用的引物為Lmm-F/R，比較兩種方法的檢出率。檢測實驗重復3次，并各抽取5份陽性檢測產物送往上海生工測序，其中qPCR陽性產物需先克隆至pUCm-T載體再進行測序。

2 結果

2.1 標準質粒的構建

從感染鰻鱺圓環病毒的病料中提取總DNA作為模板，用引物對RAP-F/R進行擴增，得到861 bp的片段(圖1)。經測序分析顯示，擴增獲得的EeCV-RAP與GenBank中的EeCV參考株(KU951579.1)replication-associated protein的序列完全一致。進一步將該片段克隆至載體，經單酶切和測序鑒定，獲得重組質粒pUCm-T-RAP。

圖1 EeCV RAP的PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of EeCV RAPM：DL2000 DNA marker，1：EeCV-RAP，2：陰性對照。

2.2 EeCV SYBR Green I qPCR 標準曲線的建立

10倍比稀釋質粒pUCm-T-RAP DNA至為1.0×108～102拷貝數/μL作為模板，進行qPCR擴增，繪制Ct值與質粒拷貝數的lg對數之間的標準曲線。Ct值與質粒拷貝數的lg對數的線性關系為y=-2.853 6x+31.999，相關系數R2為0.995 1(圖2)，表明該qPCR方法的Ct值與1.0×108～102拷貝數/μL標準質粒有較好的線性關系。1.0×108～102/μL標準質粒的熔解曲線均只有一個熔解峰，熔解溫度區間為82.24～83.15 ℃(圖3)，表明qPCR反應產物均為圓環病毒的特異性擴增產物，并無非特異性擴增或引物二聚體產生。

圖2 EeCV SYBR Green I qPCR檢測的標準曲線Fig.2 Standard curve plot of the EeCV SYBR Green I qPCR assay

圖3 EeCV SYBR Green I qPCR檢測的熔解曲線Fig.3 Metting curve of the EeCV SYBR Green I qPCR assay

2.3 EeCV SYBR Green I qPCR的靈敏性、特異性和重復性檢測

將pUCm-T-RAP梯度稀釋至1.0×108～100拷貝數/μL作為模板，分別進行SYBR Green I qPCR和普通PCR擴增。結果顯示，普通PCR的最低檢出拷貝數為1 000拷貝數/μL(圖4a)，1.0×102～100拷貝數/μL無法擴增；而SYBR Green I qPCR的最低檢出拷貝數可達100拷貝數/μL，1.0×101～100拷貝數/μL無法擴增(圖4b)；SYBR Green I qPCR法比普通PCR法的靈敏性高10倍。

圖4 普通PCR和SYBR Green I qPCR檢測靈敏度Fig.4 Sensitivity of conventional PCR assay and SYBR Green I qPCR assay in detection of EeCVa：EeCV普通PCR的檢測靈敏性，M：DL2000 DNA marker，1～9：108～100個拷貝的重組質粒，10：陰性對照；b：EeCV SYBR Green I qPCR的檢測靈敏性，1～9：108～100個拷貝的重組質粒，10：陰性對照。

以鰻鱺皰疹病毒、豬圓環病毒、鴨圓環病毒、羅非魚湖病毒、鰻鱺、遲鈍愛德華菌和維氏氣單胞菌的基因組和pUCm-T-RAP為模板，進行SYBR Green I qPCR擴增的特異性檢測。pUCm-T-RAP有擴增曲線產生，而鰻鱺皰疹病毒、豬圓環病毒、鴨圓環病毒、羅非魚病毒和陰性對照均無擴增信號(圖5)，表明SYBR Green I qPCR擴增法具有良好的特異性。

圖5 EeCV SYBR Green I qPCR檢測特異性Fig.5 Detection specificity of the EeCV SYBR Green I qPCR assay1：EeCV，2：Anguillid herpesvirus，3：Duck circovirus，4：Tilapia lake virus，5：Porcine circovirus，6：Anguilla japonica，7：Edwardsiella tarda，8：Aeromonas veronii，9：陰性對照。

取3個不同濃度的pUCm-T-RAP標準品(1.0×106、1.0×105、1.0×104個拷貝數/μL)和1個臨床樣品作為模板進行qPCR擴增，檢測SYBR Green I qPCR方法的重復性。組內變異系數和組間變異系數均小于3%，組內變異系數分別為2.24%、1.66%、2.82%和0.41%；組間變異系數分別為2.66%、2.01%、2.39%和1.59%(表2)，表明SYBR Green I qPCR方法的檢測結果具有穩定性和可靠性，重復效果好。

表2 EeCV SYBR Green I qPCR的重復性Tab.2 Detection repeatability of the EeCV SYBR Green I qPCR

2.4 EeCV SYBR Green I qPCR方法的應用

用建立的EeCV SYBR Green I qPCR方法檢測感染圓環病毒的鰻鱺體內不同組織的病毒載量差異，結果顯示，在鰻鱺的肝臟、皮膚黏液、腎臟、鰭、脾臟、腸道、心臟和鰓均可檢測到EeCV，并且在鰓部的EeCV含量顯著高于其他組織(圖6)。

圖6 EeCV感染鰻鱺主要組織內EeCV的分布情況Fig.6 Distribution of EeCV in the primary tissues of eels infected with EeCV1：肝臟，2：皮膚黏液，3：腎臟，4：鰭，5：脾臟，6：腸道，7：心臟，8：鰓。

用普通PCR法和建立的EeCV SYBR Green I qPCR方法對實驗室收集的44份疑似鰻鱺病毒感染病料進行檢測。結果顯示，普通PCR法共檢出32份陽性樣品，陽性檢出率為73%；而SYBR Green I qPCR法檢出43份陽性樣品，陽性檢出率為98%。實驗重復3次，結果均一致，PCR法檢出的樣品，qPCR法都能檢出。并各抽取5份陽性檢測產物進行測序分析，其中qPCR陽性產物需先克隆至pUCm-T載體再進行測序。測序結果確為EeCV基因序列，排除假陽性干擾，表明SYBR Green I qPCR法比普通PCR法更為靈敏。

3 討論

圓環病毒最開始是從豬和鸚鵡體內檢測到的[14，15]，后來隨著檢測技術的不斷進步，從低脊椎動物和無脊椎動物中也發現大量和圓環病毒的相關序列[10，12，16]。ANDOR等[13]在2014年從歐洲鰻鱺身上分離得到的了一株新型圓環病毒，并進行全基因組測序，其臨床病變特征為頭部區域出現乳頭狀腫瘤。其實歐洲鰻鱺的這種病變早在20世紀初的北歐河流的支流地區就已經出現過[17]。目前國內養殖的鰻鱺品種感染圓環病毒的臨床癥狀與上述歐洲鰻鱺的臨床癥狀不盡相同，其臨床癥狀主要表現為爛鰓后“開窗”、紅頭、喉部囊腫，發病癥狀酷似鰻鱺皰疹病毒感染出現的脫黏、敗血、紅頭等現象[18]。

由于過往對鰻鱺圓環病毒病認識不深且診斷技術較為落后，該病毒性疾病未能被準確診斷，也未能引起重視，但近幾年隨著診斷技術的不斷提升，鰻鱺圓環病毒的檢出陽性率似乎在逐漸提高，如李苗苗[4]2018年在160份福建省鰻鱺樣品中陽性檢出率就高達40.6%。這也說明圓環病毒可能比之前預想的要廣泛存在。因此建立高效、準確的檢測手段對防控鰻鱺圓環病毒病有重要意義。SYBR Green I qPCR檢測方法廣泛應用于病原檢測，目前圓環科中的鴿圓環病毒(Pigeoncircovirus)[19]、豬圓環病毒[20]、鴨圓環病毒[21]和犬圓環病毒(Caninecircovirus)[22]都已建立SYBR Green I qPCR方法，其中豬圓環病毒不僅1型[20]、2型[23]、3型[24]和4型[25]都分別建立了熒光定量PCR檢測法，甚至還拓展出了雙重熒光定量PCR法[26]和三重熒光定量PCR法[27]，大大提升了豬圓環病毒的陽性檢出率。

而鰻鱺圓環病毒目前僅建立了普通PCR檢測法，還存在無法準確定量、低拷貝病毒無法準確檢測等缺點[19]。為解決上述問題，本研究基于SYBR Green I qPCR檢測方法的快速、準確、操作簡單和易于實現的特點[2]，建立了EeCV SYBR Green I qPCR檢測方法。在該方法中，其標準曲線的相關系數可達0.995 1，線性范圍廣(1.0×108～102拷貝數/μL)，這與其它類別圓環病毒構建的熒光定量法線性范圍類似，如豬圓環病毒4型檢測下限為5.64×102copies/μL[25]，犬圓環病毒的Ct值與標準品在6.18×109～6.18×102copise/μL范圍內呈良好的線性關系[22]；重復性好，組內和組間變異系數都小于3%；靈敏性高，是普通PCR法的10倍，在臨床應用上的結果也表明qPCR方法對疑似EeCV樣品的陽性檢出率遠高于普通PCR法；特異性強，與其近緣DNA病毒(豬圓環病毒、鴨圓環病毒)無交叉擴增，和鰻鱺其它常見病毒(鰻鱺皰疹病毒)也無交叉擴增；在感染EeCV的鰻鱺重要組織中，鰓的病毒量顯著高于其他組織(P<0.05)，與鰻鱺圓環病毒病會出現爛鰓的主要臨床特征相吻合；對保存的44份疑似鰻鱺病毒性感染病料進行檢測，陽性檢出率為98%，也表明了該檢測方法具有較好的實際應用效果。其它病毒建立的熒光定量方法也存在臨床樣品陽性檢出率高于普通PCR的情況，鴿圓環病毒熒光定量PCR方法對臨床樣品陽性率達75.7%，高于常規PCR方法的檢測陽性率(54.1%)[19]；鴨圓環病毒實時熒光定量PCR方法檢出率為26.4%，明顯優于常規PCR檢測結果15.3%[21]。

綜上所述，EeCV SYBR Green I qPCR為準確、快速地定量檢測臨床樣品中的EeCV提供了新方法，可應用于EeCV病的診斷和流行病學研究。