基于DNA條形碼、多重PCR、熒光定量PCR對九香蟲及其混偽品進行鑒定

王孟虎　孫一帆　左亞鋒　孟祥松　栗進才　俞浩　許亮　康廷國

摘 要：目的：基于DNA條形碼、多重PCR、熒光定量PCR對市售九香蟲、小皺蝽及其摻雜樣品進行鑒定。方法：利用通用引物COI進行擴增并測序，構建NJ系統發育樹、二級結構并計算種內種間遺傳距離；基于COI序列設計九香蟲、小皺蝽特異性引物并進行電泳，比較電泳條帶；基于COI引物進行SBYR熒光定量PCR，觀察單一樣品及不同比例混合樣品的熔解曲線及其Tm值。結果：利用MEGA 11.0軟件分析顯示九香蟲、小皺蝽分別單獨聚為一支，其種間遺傳距離均大于0.22，種內遺傳距離均小于0.02；兩者的二級結構在整體框架具有明顯不同。基于特異性引物擴增的九香蟲、小皺蝽均出現單一條帶，不同比例的混合樣品與混合引物進行擴增均出現2條條帶。基于COI引物擴增的九香蟲、小皺蝽熔解曲線Tm值分別為75℃、89℃，不同比例混合樣品的熔解曲線Tm值分別在75.00℃、89.00℃出現兩個峰值。結論：DNA條形碼能夠及二級結構準確鑒定九香蟲、小皺蝽；多重PCR及基于SBYR熒光定量PCR不僅能夠準確對單一九香蟲、小皺蝽進行鑒定，也能夠對不同比例的混合樣品進行準確鑒定。

關鍵詞：DNA條形碼；多重PCR；熒光定量PCR；二級結構；九香蟲

中圖分類號：R932? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2023）02-0060-06

九香蟲為蝽科昆蟲九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥體[1]，其藥用歷史悠久，是一種藥用價值較高、營養價值較高的昆蟲類中草藥和保健食品[2]，具有抗菌[3]、抗癌[4]、鎮痛[5]、抗氧化[6]及改善生殖器官[7]的作用。已報道的九香蟲化合物包括脂肪酸、蛋白質、氨基酸、臭氣類、核苷類、多巴胺類化合物及其他營養成分。九香蟲體內脂肪酸類化合物最多，包括油酸、亞油酸、軟酸、軟亞油酸、硬亞油酸等[8]。由此可見，九香蟲脂肪油主要是不飽和脂肪酸，占70%以上。另外九香蟲還富含維生素、微量元素、磷脂、蛋白質及氨基酸，維生素中含有的維生素A及維生素C的含量較高。

市售九香蟲常見的混偽品是小皺蝽，小皺蝽除略小于九香蟲外，其他形態特征與其相似，小皺蝽常冒充小的九香蟲進行銷售，若兩者進行摻雜，極難鑒別。黃秋強等[9]人借助生物顯微鏡及掃描電鏡對九香蟲、小皺蝽進行鑒別，發現兩者的區別主要在腹背板。鞠康等[10]人對九香蟲及其混淆品微性狀鑒別研究，發現在頭部、前胸背板、小盾片、腹側緣、前翅、生殖節等方面均有較明顯的區別。李莎等人[11，12]發現九香蟲及其混偽品藥材性狀和顯微鑒別可以通過腹背板進行鑒別；通過DNA條形碼技術和九香蟲的線粒體基因測序技術能夠準確鑒定九香蟲及其混偽品。

傳統鑒定方法可以通過性狀、顯微進行鑒定，但其無法對摻雜一定比例的九香蟲藥材準確鑒定摻雜基原。多重PCR技術是基于每個物種基因設計特異性引物，基于特異性引物擴增的產物堿基長度不同，進行電泳后其條帶位置不同，進而對物種進行準確鑒定。利用SBYR熒光定量PCR進行擴增，其熔解曲線與堿基長度及堿基組成比例有關，設計的特異性引物擴增的產物堿基組成及長度不同，其熔解曲線亦不相同，根據熔解曲線Tm值不同進行對物種進行鑒定[13]。

1 材料與試劑

1.1 材料

從康美市場購買九香蟲正品5批次、小皺蝽5批次，九香蟲標記分別為JXC-01？JXC-05，小皺蝽標記分別為XZC-01？XZC-05。所有樣品均經孟祥松主任中藥師鑒定，所有樣品儲存均存放在亳州學院冷庫內。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量PCR（伯樂，CFX Connect），PCR儀（伯樂，T100）、低溫冷凍研磨儀（上海凈信，JX-CL）、全自動數碼凝膠成像分析儀（上海培清，JS-2000）、JOANLAB多功能混勻儀（群安實驗儀器、VN-500Pro）、IKA漩渦混合器（艾卡，Vortex-1）、移液槍（賽默飛世爾）（ThermoFisherF3）、電泳儀（北京六一，EPS300）、粉碎機（美的，MJ-FP12X2-100）、Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒（生工，FC09KA4055）、DNA分子量標準Marker（2000bp）（生工、B500350-0500）、SYBRGreen染料Mix（生工，I308KA3871）、4SGelRed（BBI，A616697-0500）、2×TaqMasterMix（諾唯贊，7E341F9）、TAE（50×）（biosharp，691176248）、瓊脂糖（恒奧生物，EZ6688C178）。

2 方法

2.1 DNA提取

取九香蟲、小皺蝽適量，用粉碎機粉碎，稱量粉末約30mg加入1.5mL離心管中，并向其中加入180uL的Buffer ACL及研磨珠，在低溫冷凍研磨儀研磨1min（60次/秒），低速離心去除泡沫，剩余操作均與Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒說明書相同，提取的DNA放置在-20℃冰箱內儲存備用。

2.2 PCR擴增體系及反應條件

COI序列擴增正反引物詳見表1。PCR擴增體系為50μL，含有正反向引物各2.0μL（2.5μmol/L），穩定劑和溴酚藍燃料（TaqMasterMix）25μL，總DNA4.0μL（約40ng），加去RNA酶水17μL。擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min（35個循環）；72℃延伸5min。

2.3 電泳檢測DNA質量

使用2.0%的瓊脂糖凝膠液倒入電泳槽中，靜置30min，用移液槍吸取PCR擴增產物5.0μL、Marker 2.0μL，在120V電壓下電泳25min，取出放置凝膠成像系統中分析，與Marker比較后無雜帶并且清晰時拍照保存圖像。

2.4 測序

擴增成功的PCR產物委托上海生工進行測序，測序產物為PCR反應物，測序前PCR擴增產物經純化再進行雙向測序，獲得雙向測序原始序列堿基及峰圖。

2.5 數據處理

測序所得的原始序列利用CodonCode Aligner 17.0軟件進行查看、拼接校對，去除低質量的序列及引物區，以堿基質量不低于20為標準。將測得的COI序列用軟件MEGA11.0比對分析，去除多余的堿基。基于K2P模型進行種間變異位點和遺傳距離分析，基于COI序列構建二級結構及系統聚類樹，利用bootstrap（1000次重復）檢驗各分支的支持率。

2.6 特異性引物設計

根據所測的COI基因序列，利用軟件MEGA 11.0比對找到變異位點，利用Oligo 7.0軟件手動設計特異性引物并在NCBI上進行引物Blast分析，確保設計的引物對九香蟲、小皺蝽均具有特異性，且其PCR擴增長度不同，設計的引物詳見表1。

2.7 多重PCR擴增

將特異性引物分別與對應的模板進行擴增，擴增成功后進行電泳，觀察擴增產物電泳條帶位置。將九香蟲、小皺蝽DNA按1：1、3：1、6：1、9：1混合，加入混合引物和單一引物進行擴增，將擴增產物電泳，觀察電泳條帶位置。

2.8 多重熒光定量PCR[15]

多重熒光定量PCR擴增程序為：95℃ 3min；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 15s，45cycles；熔解曲線程序為：95℃ 1min；58℃ 30s，0.5℃/min，升溫至95℃。PCR反應體系為SYBR Green Mix 12.5μL，正反引物各1μL，模板2μL，加雙蒸水至25μL。將特異性引物、模板、SBYR染料等混合后分別進行擴增，記錄其擴增產物的熔解曲線Tm值。將九香蟲、小皺蝽DNA按1：1、3：1、6：1、9：1混合，分別加入混合引物進行擴增，記錄其熔解曲線Tm值。

3 結果

3.1 DNA擴增檢測

基于COI引物進行普通PCR擴增，產物并分別進行電泳，電泳條帶清晰，表明DNA提取及擴增成功。基于COI引物進行熒光定量PCR擴增，擴增產物進行熔解曲線分析，其熔解曲線峰為單峰，說明PCR擴增成功，詳見圖1。

3.2 種內、種間遺傳距離分析

將拼接、去引物的COI堿基序列利用MEGA 11.0軟件進行比對，長度為555bp。九香蟲種內遺傳距離為0.00～0.004，小皺蝽種內遺傳距離為0.00～0.009，種間遺傳距離為0.225～0.233，具體詳見表2。九香蟲與小皺蝽種間堿基不同位點有106個，九香蟲種內堿基變異位點有2個，小皺蝽種內堿基變異位點有6個。由表可知，九香蟲、小皺蝽種內遺傳距離均小于0.020，種間遺傳距離遠大于0.020，說明利用遺傳距離能夠準確鑒別九香蟲、小皺蝽。

3.3 二級結構

利用載體家（https：//www.vectorbuilder.cn/tool/dna-secondary-structure.html）在線網頁對所有樣品的堿基序列進行二級結構構建，詳見圖2。由圖可知，JXC-01～JXC-03二級結構基本相同，JXC-04、JXC-05二級結構基本一致，JXC-01與JXC-04相比，種內二級結構主要有3處不同。XZC-01、XZC-02種內二級結構基本相同，XZC-03、XZC-04、XZC-05與XZC-01相比分別有2、1、2處主要結構不同。從構建二級結構中可以看出，九香蟲種內二級結構大致相同，小皺蝽種內二級結構雖有1～2處不同，但整體框架是相同的。而九香蟲與小皺蝽在種間的二級結構整體框架是不同的，具有明顯的不同。說明利用二級結構不僅可以對種間進行鑒別，對種內有少量堿基變異的序列也能夠顯示出來。對于種內變異較少或遺傳距離較近的堿基序列，可以通過構建二級結構來更直觀地看到發生的堿基變異。

3.4 NJ系統發育樹

從GenBank上下載九香蟲同屬物種黑兜蟲（A. nigriventris Westwood）、小皺蝽同屬物種刺桐蝽（C. siccifolia Westwood）的COI堿基序列，序列號分別是JQ387600.1、MG838353.1，簡稱分別是GB-HDC、GB-CTC。對九香蟲、小皺蝽測序獲得的堿基序列及GenBank上下載的堿基序列利用MEGA11.0軟件進行比對分析，設置bootstrap（1000次重復），構建NJ系統發育樹，詳見圖3。由圖可知，九香蟲、小皺蝽、黑兜蟲、刺桐蝽分別單獨聚為一支，九香蟲與黑兜蟲聚為一大支，小皺蝽、刺桐蝽聚為一大支，這與現代分類親緣關系一致。說明利用NJ系統發育樹不僅能夠將四種物種進行準確鑒定，也能夠判別物種的親緣關系，對現代物種分類提供一定的技術支持。

3.5 多重PCR特異性引物檢測

將九香蟲、小皺蝽的特異性引物分別與對應的模板、混合模板進行PCR擴增，擴增后的產物進行電泳，電泳條帶詳見圖4。單一模板及混合模板分別與對應特異性引物進行擴增，其擴增成功率均為100%。由圖可知，九香蟲在400～500bp間出現條帶，小皺蝽在200～300bp間出現條帶，這與九香蟲、小皺蝽擴增產物堿基長度為473bp、255bp相對應，說明設計的引物具有特異性。

3.6 多重PCR靈敏度檢測

提取按一定比例混合的九香蟲、小皺蝽樣品總DNA，并分別與單一引物、混合引物分別進行擴增，擴增產物進行電泳，詳見圖4。九香蟲：小皺蝽按1：1、3：1、6：1、9：1混合提取總DNA及擴增產物用A、B、C、D表示，其中B1、C1、D1和E1為混合樣品DNA與混合特異性引物擴增產物的條帶，B2、C2、D2和E2為混合樣品DNA與九香蟲的特異性引物擴增產生的條帶，B3、C3、D3和E3為混合樣品DNA與小皺蝽的特異性引物擴增產生的條帶。

由圖可知，B1、C1、D1、E1均能產生兩條特異性條帶，分別是九香蟲擴增產物長度473bp和小皺蝽擴增產物長度255bp；B2、C2、D2、E2為單一條帶，其長度為473bp，B3、C3、D3、E3為單一條帶，其長度為255bp。說明利用多重PCR技術設計特異性引物，其擴增產物通過電泳后，根據電泳條帶的有無來判斷樣品的基原及摻雜情況，鑒定摻雜的比例可達到10%，通過一次提取樣品，就能夠對樣品的基原進行準確鑒定。

3.7 熒光定量PCR單一樣品檢測

九香蟲、小皺蝽分別在與COI引物進行熒光定量PCR反應后，啟動熔解曲線程序，九香蟲、小皺蝽熔解曲線均為單峰，測得九香蟲的Tm值為75℃，小皺蝽的Tm值為89℃。

3.8 熒光定量PCR混合樣品靈敏度檢測

將混合樣品分別按照1：1、3：1、6：1、9：1提取總DNA，向混合DNA加入COI引物，按照熒光定量PCR反應體系及反應程序進行擴增并測定其熔解曲線的Tm值，詳見圖5。

由圖可知，九香蟲：小皺蝽按1：1、3：1、6：1、9：1比例混合的樣品其Tm值均約為75℃、89℃，而九香蟲、小皺蝽單一DNA的Tm值分別是75℃、89℃，說明基于COI引物可以對九香蟲摻雜小皺蝽的樣品進行準確鑒定，且小皺蝽的Tm值不隨樣品比例增減而改變，具有很好的操作性及識別度。

4 討論

九香蟲、小皺蝽分別屬于蝽科（Pentatomidae stinkbug）九香蟲亞科（Dinidoronae）兜蝽屬（Aspongopus）、皺蝽屬（Cydopelta），為同科不同屬的物種，兩者親緣關系相對較遠，故可以利用分子鑒定技術對其進行鑒定。通過DNA條形碼、多重PCR、熔解曲線分別對九香蟲、小皺蝽進行研究，發現均能夠對兩者進行有效鑒別。其中九香蟲、小皺蝽種間遺傳距離均大于0.2，說明兩者親緣關系相對較遠。二級結構不僅能夠對九香蟲、小皺蝽進行準確鑒定，種內較少的堿基變異也能夠讓二級結構發生改變，從而更加直觀觀察到種內堿基變異。基于COI堿基序列構建的NJ系統發育樹能夠準確將九香蟲、小皺蝽、黑兜蟲、刺桐蝽鑒別開且根據聚類樹可以對親緣關系進行判別。

基于多重PCR技術設計九香蟲、小皺蝽特異性引物進行擴增，單一模板、混合模板與單一引物進行擴增，均能夠得到明亮的單一條帶。不同比例的混合模板與混合引物進行PCR擴增時，在小于100bp、400～500bp、200～300bp出現3條電泳條帶，其中小于100bp的條帶最亮，擴增產物的兩條條帶均比較暗淡，不同比例的混合模板條帶亮度基本一致。不同比例的混合模板與分別與九香蟲、小皺蝽特異性引物進行擴增，擴增產物均出現2條條帶，小于100bp的條帶基本上比目標條帶要亮。以上小于100bp的條帶均較亮說明在反應過程中出現了引物二聚體，抑制了目的基因進行擴增的速率，導致即使增加模板濃度也不能夠進行有效擴增目的基因。混合引物進行擴增時，引物二聚體擴增的效率大大提升，導致混合模板與混合引物進行擴增時，雖然目的基因都能夠擴增成功，但目的條帶亮度均沒有達到引物二聚體、混合模板與單一引物擴增條帶的亮度，其中亮度為引物二聚體>單一引物>混合引物。雖然設計的引物有引物二聚體產生，但依然能夠有效鑒別九香蟲摻雜10%小皺蝽的樣品，說明該方法可行，特異性引物有待進一步優化。

基于熒光定量PCR技術對九香蟲、小皺蝽進行鑒定，分別與COI引物進行擴增，其熔解曲線Tm值分別為75℃、89℃，但九香蟲有一處小峰，Tm值約為66℃，可能為引物二聚體的Tm值，小皺蝽的Tm值峰形較好且無引物二聚體峰。按1：1、3：1、6：1混合模板與COI引物進行擴增時，均出現引物二聚體峰，九香蟲的峰形發生較大變化但依然呈現單峰，小皺蝽的峰形保持不變。說明小皺蝽即使模板濃度降低，但其熔解曲線的峰形及Tm值保持不變，利用該方法對九香蟲中摻雜小皺蝽的鑒定率可以達到10%的靈敏度，甚至可以有更高的靈敏度。

基于DNA條形碼、多重PCR、熒光定量PCR均能夠對九香蟲、小皺蝽進行鑒定及鑒別，多重PCR、熒光定量PCR均能夠達到10%的靈敏度，對摻雜小皺蝽的九香蟲進行準確鑒別，為摻雜一定比例小皺蝽的九香蟲鑒定提供一定的思路及方法，為穩定九香蟲市場提供一定的技術支撐。

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收稿日期：2022-10-23

通訊作者：許亮（1978-），男，遼寧沈陽人，博士，教授。研究方向：中藥鑒定與品質評價。

基金項目：遼寧省“百千萬人才工程”資助項目；安徽高校自然科學研究項目（KJ2021A1143；KJ2020A0765）；亳州學院科研項目（BYZ2017C02；BYZXKTD202004；BYH202108）；高校學科（專業）拔尖人才（gxbjZD2020095）