水生生物增殖放流及微衛星DNA標記在增殖放流中的應用

王子維 李偉緣 張琦 劉奇

關鍵詞：水生生物；增殖放流；微衛星DNA標記；效果評估

伴隨著海洋工程建設、環境污染和過度捕撈，我國近海漁業資源出現衰退，甚至一些種類面臨枯竭，漁獲物明顯呈現出低齡化、小型化和低值化［1］。以分布在我國渤海的小黃魚（Larimichthys polyactis） 為例，其資源量顯著減少，群體特征也發生了顯著變化。如在1960年，捕獲到的小黃魚平均體長為205.8 mm，到2003年僅為130.3 mm，平均體長呈現出下降趨勢。對年齡組成分析也發現，1960年小黃魚漁獲物年齡范圍為1～21齡，自1993年開始僅為1～2齡，目前所捕獲到的小黃魚以一齡魚甚至年齡更小的個體居多［2］。

針對漁業資源衰退的現狀，國內外相繼出臺并完善了漁業資源管理制度，旨在利用制度建設來實現漁業資源的可持續發展，這其中包括：漁業權制度、捕撈限額制度、捕撈配額制度和增殖放流行動方案［3］。其中，增殖放流是指將孵化場人工培育的幼體投放到天然水域中，進而補充自然群體，達到緩解漁業資源衰退的目的［4］。增殖放流不僅可以增加水生生物種群數量、捕撈產量，還可以有效地改善水域環境、優化水域群落結構和保持生態平衡［5］。成功的增殖放流活動可以取得明顯的經濟、生態和社會效益。

依靠增殖放流來增加特定水域漁業資源量的方法已有百年歷史。如較早的增殖放流是把自然水域中的亞洲鯉（Cyprinus carpio）投放到另一個特定水域中，以達到引種和增加漁業資源的目的［6］。但伴隨水生生物人工繁育技術的突破和不斷完善，世界上許多國家相繼開展了多種類、大規模的水生生物增殖放流活動，如挪威、日本、美國、中國等。

日本作為開展水生生物增殖放流活動較早的國家之一，早在上世紀60年代初就開始針對洄游路線較固定的魚類和活動范圍較小的貝類開展放流，如真鯛（Pagrus major）和皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）等［7］。之后經過幾十年的不斷探索和改革，日本沿岸增殖放流不斷完善。據有關資料顯示，1999年，日本在沿岸海域開展了大規模的增殖放流活動，放流種類多達82種，累計放流數量高達153.01億尾，這其中主要包括圓斑星鰈（Verasper variegatus）、尖吻黃蓋鰈（Pseudopleuronectes herzensteini）和褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）等在內的8種鲆鰈類魚類［8］。近十余年來，日本多以大規模、持續性的魚類、甲殼類經濟物種增殖放流居多，如真鯛、褐牙鲆和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［9-10］。截至目前，有多達30種水生生物的年放流量已超過百萬尾（只）以上，一些種類表現出良好的增殖放流效果，如蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）［11］。

美國增殖放流活動始于19世紀后期，其目的是為了恢復因工程建設而遭到破壞的漁業資源量，但前期效果并不顯著。進入20世紀， 隨著苗種人工繁育技術提高和增殖放流策略的日益完善，增殖放流效果得以提升，漁業資源量也得以恢復［12］。截至目前，美國增殖放流種類超過20種，放流物種主要為經濟價值較高的鮭鱒魚類，如駝背大麻哈魚（Oncorhynchus gorbuscha）和大馬哈魚（O. keta） ［13］。除此之外，加拿大、挪威、俄羅斯和我國也陸續開展了鮭鱒魚類的增殖放流工作。

我國真正意義上的水生生物增殖放流活動始于上世紀50年代。隨著四大家魚人工繁育的成功，先后將青魚（Mylopharyngodon piceus）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichys nobilis） 等數十種魚類苗種投入淡水開展增殖放流［14］。而我國近海開展增殖放流活動起步相對較晚，1985年遼寧省率先開展了中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）的增殖放流活動。之后陸續在沿岸各水域根據沿岸生態條件、物種的生物學特性開展了包括魚類如許氏平鲉（Sebastes schlegelii），甲殼類如三疣梭子蟹，貝類如蝦夷扇貝，棘皮動物如刺參（Apostichopus japonicus）等的增殖放流活動［15］。經過幾十年的發展，我國增殖放流規模不斷擴大，技術不斷完善，并取得了顯著的成效。據統計，2004—2013年期間，我國累計放流水生生物苗種達2 316.10億尾，投入資金52.12億元［16］。2021年，全國共進行增殖放流活動2 700余次，累計放流各類水生生物苗種440.53億尾。其中，放流梭子蟹、對蝦等海洋生物苗種數量達319.93億尾。

對國內外的增殖放流研究發現，水生生物增殖放流雖然會帶來一定經濟效益，但存在的一些問題不容忽視，如放流與野生種群競爭加劇、破壞固有野生種群遺傳結構等［17-18］。因此，對水生生物增殖放流后的整體效果評估顯得尤為重要。

1 分子標記種類及其應用

1.1 分子標記的種類

隨著水生生物增殖放流活動在世界范圍的規?；_展，僅僅通過放流數量和漁業產量的關系來評估增殖效果顯然是不合理的。自20世紀80年代以來，隨著分子生物學的迅猛發展，分子標記被廣泛應用于個體識別和種群特征解析［19］。因其不受外界環境和發育階段的影響，能從DNA水平上直接反映出基因組的變化差異，并克服傳統標志方法對水生生物機體的損傷，現已成為評估增殖放流效果的有效標記手段［20-21］。

分子標記一般是指以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映［22］。分子標記方法主要有隨機擴增多態性DNA（RAPD）、限制性酶切片段長度多態性（RFLP）、擴增片段長度多態性（AFLP）、簡單重復序列（SSR） ，即微衛星DNA（Microsatellites DNA）以及單核苷酸多態性（SNP）等標記。而微衛星DNA標記在目前水生生物增殖放流效果評估中應用較為廣泛。

1.2 微衛星DNA標記

微衛星DNA標記，具有含量豐富，多態性高，片段較小，在基因組中分布均勻，雜合度高，且重復性好，測序結果穩定，對DNA模板要求低；此外也屬于共顯性遺傳標記，有益于個體識別。基于微衛星DNA標記，經親緣關系分析，能準確的區分開放流群體和野生群體，并以此來估算回捕率或放流群體占總回捕群體的比例（重捕比例），從而有效掌握增殖放流效果。另一方面，在增殖放流監測過程中，利用微衛星DNA標記可以同時開展放流群體遺傳多樣性和適應性等相關研究，可以較全面、有效地評估水生生物增殖放流效果［23］。

1.2.1 微衛星DNA標記在回捕調查中的應用 近年來，微衛星DNA標記在水生生物增殖放流回捕率或重捕比例評估中的應用案例逐漸增多。早期Sekino等［24］利用4個微衛星位點，并以線粒體DNA測序分析作為輔助手段對褐牙鲆放流群體進行回捕分析，最終從149尾回捕群體中成功地識別出35尾為當年放流個體。Jeong等［25］利用5對高多態性的微衛星DNA標記對2001年日本廣島灣黑鯛 （Acanthopagrus schlegelii） 放流群體進行回捕調查，經親子鑒定發現，在199尾回捕群體中有117尾為當年放流個體，即放流群體占總回捕群體的比例為58.8%。Liu等［26］在2015年遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流效果評估中，使用6對高多態性的微衛星DNA標記對50只繁殖親蟹和1 671只回捕蟹群體開展親子鑒定，以探究放流群體對野生群體的資源貢獻率，結果顯示，回捕群體中有120只為當年放流蟹，1 551只為野生個體，即重捕比例為7.2%。劉勝男等［27］利用9對多態性較高、穩定性較好的微衛星DNA標記對2017年5月我國在北部灣東興附近海域放流的長毛對蝦（P. penicillatus）進行效果評估中，于2017年9月至2018年2月逐月開展回捕，基于親子關系分析，發現在回捕到的517尾長毛對蝦中，有202尾為當年放流個體，放流個體占回捕個體的比例為39.07%。月間回捕比例（當月回捕到的放流個體占月回捕總數的比例）在25%～57%之間。大量研究發現，利用多態性高、穩定性好的微衛星DNA標記對回捕群體開展放流個體識別可以取得可靠效果，相較于SNP標記，使用微衛星DNA標記開展個體識別的測序成本較低，適用于在大規模增殖放流中使用。

1.2.2 微衛星DNA標記在增殖放流遺傳學評估中的應用 負責任的增殖放流模式應保障人工放流群體的遺傳多樣性，遺傳結構的穩定，從而減少人工放流對野生群體的遺傳影響［28］。因此，在增殖放流過程中開展遺傳學評估顯得尤為重要。An等［29］在韓國沿海地區進行花鱸（Lateolabrax maculatus）增殖放流活動前，利用12個高多態性的微衛星位點評估了養殖種群和野生種群之間的遺傳多樣性，結果顯示兩種群均具有較高的遺傳多樣性。Liu等［30］對我國渤海海域褐牙鲆的增殖放流效果進行了評估，利用8對高多態性的微衛星DNA標記對繁殖親本群體和回捕群體開展基因型分析，并基于親子鑒定技術，最終成功地區分開回捕群體中放流群體與野生群體。在對兩群體進行遺傳分析時發現，放流群體和野生群體間的平均觀測雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）無顯著差異 （P>0.05） ，表明放流群體在放流后維持了較高的遺傳多樣性，對野生群體的遺傳多樣性暫未產生負面影響。Wang等［31］通過7個高多態性的微衛星位點對我國南海大亞灣海域放流的黑鯛種群進行分析調查，最終成功地在回捕群體中識別出當年放流個體。然而，在對放流前后各群體的遺傳多樣性分析發現，回捕群體的平均等位基因豐度（Ar）、平均觀測雜合度（Ho）、平均期望雜合度（He）較放流前采集的野生群體均有所降低，暗示此次的增殖放流活動可能會對野生群體的遺傳多樣性產生一定負面影響。

1.2.3 微衛星DNA標記在放流群體適應性評估中的應用 人工繁育苗種生長環境不同于野生群體，棲息地環境的差異容易造成對環境的適應性出現一定的分化。在水生生物增殖放流過程中，有必要從生長狀況和攝食生態這兩方面對人工放流群體在自然水域中的適應性進行評估。Wang等［32］在我國渤海海域褐牙鲆增殖放流過程中，通過形態學比較、線粒體DNA （mtDNA） 和微衛星DNA標記分析，成功地區分開放流群體與野生群體，在比較兩群體全長、體質量 、肥滿度 、魚體脂質水平 和胃含物指數差異時發現，兩群體間均無顯著差異（P>0.05），且攝食均以魚類為主，因此可以推論放流群體能適應自然水域環境。Liu等［23］利用9對高多態性的微衛星DNA標記對2019年我國黃海北部海域許氏平鲉放流效果進行評估，經親子鑒定，成功地從710尾回捕個體中識別出279尾為當年放流個體，在對放流群體與野生群體生長狀況、攝食生態情況分析時發現，兩群體間個別形態學參數存在顯著差異（P<0.05），表現為放流個體體型似乎更大、尤其頭部部位，此外放流群體的腹鰭更??；而攝食參數評估表明放流群體已經能夠適應放流區的野生環境，攝食情況與野生群體無明顯差異（P>0.05） 。

2 對增殖放流策略及放流效果評估的建議

前期研究表明，增殖放流雖能在一定程度上達到補充原有資源量的目的，但有時也可能給放流水域野生種群帶來負面的遺傳影響或生態影響。因此，增殖放流過程的每一階段都應做好科學規劃，使增殖放流的經濟效果最大化，減少負面的遺傳和生態影響，使人工增殖放流達到預期的效果。

參考國內外成功的放流案例，筆者建議，在接下來的增殖放流工作中，應著重把握如下關鍵點：

2.1 制定科學、合理的放流策略

在開展增殖放流前應充分考量放流后苗種的存活率、餌料來源以及是否會對野生群體造成負面的生態或遺傳影響［33］。故放流前進行放流水域實地調研是必要的，選取適宜的放流水域和放流時間，確保餌料充足。此外，因放流承擔單位開展苗種繁育的方式不盡相同，對苗種質量缺乏全面監控，很可能造成一些攜帶疾病的苗種放流到自然水域中，造成負面的生態影響［34］。故對放流苗種質量進行全面有效的監控是必要的，應選擇健康、體格健壯的苗種予以放流，以保證放流后的存活率和減少對野生群體的影響。

2.2 積極開展放流水域生態環境的保護

若放流水域生態環境惡化，會加大水生生物資源修復難度，致使增殖放流無法達到預期效果。因此，開展放流水域的生態環境保護是目前不容忽視的問題。筆者建議應加強工業污水和養殖廢水排放的管理，避免過多的工業污水和養殖廢水將攜帶的有害物質排入放流水域，造成水體污染，嚴重時會導致放流水域苗種的死亡，很可能會抑制增殖放流效果。此外應對主要放流水域設立一定范圍的禁漁區，打擊對放流早期苗種的偷捕行為，從而保障放流苗種的存活和生長 。

2.3 完善增殖放流效果評估體系

對放流水域進行回捕調查時，應充分考慮放流苗種的生活習性，對分布范圍較廣的漁業調查對象，可通過擴大調查水域面積的方式進行放流效果評估，從而使獲得的回捕率或重捕比例評估更加準確。此外在開展增殖放流效果評估時，對放流群體和野生群體開展遺傳學評估也是非常必要的，有助于有效避免負面的遺傳效應。

3 結語

增殖放流對維持生態平衡和增加漁業產值有著重要作用，但如何更好地開展水生生物增殖放流活動值得我們深入思考，筆者結合國內外水生生物增殖放流研究的最新進展及我國水生生物增殖放流的實際情況，以目前常用的微衛星DNA標記技術為切入點，介紹了該技術在個體識別、遺傳多樣性及適應性評估中的應用。同時結合多年的增殖放流理論與實踐，對水生生物增殖放流策略和效果評估提出若干建議，旨在為目前開展的水生生物增殖放流提供科學、有益的理論參考。

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Stock enhancement of aquatic organism and application of microsatellite DNA marker in stock enhancement

WANG Ziwei1 ， LI Weiyuan1， ZHANG Qi1， LIU Qi2

（1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China;2.College of Marine Science and Environment， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China）

Abstract：Taking microsatellite DNA marker technology as an example， the application of the technology in individual identification， genetic diversity and adaptability evaluation in the process of stock enhancement was systematically expounded. At the same time， suggestions on the strategy and effect evaluation of aquatic organism stock enhancement were also put forward.

Key words：aquatic organism; stock enhancement; microsatellite DNA marker; effect evaluation

（收稿日期：2022-08-10）