天津水稻穗腐病病原菌鑒定及室內毒力測定

姚玉榮　霍建飛　貴海燕　郝永娟　楊秀榮　孫淑琴　王萬立

關鍵詞：水稻穗腐病：分離鑒定：稻黑孢霉：毒力測定

中圖分類號：S435.11 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）03-0148-05

近些年，天津市大力發展小站稻的種植，天津市農委編制出臺了《天津小站稻振興規劃方案》，提出到2020年天津市小站稻種植面積穩定在5.33萬公頃，2022年達到6.67萬公頃。隨著水稻種植面積的增大，病害發生種類和危害程度日益嚴重，水稻穗腐病對水稻產量和品質有較大影響，主要癥狀為在水稻潁殼上形成褐色斑點。該病在我國主要稻區均有發生。黃世文等報道的引起杭州水稻穗腐病病原菌主要為細交鏈格孢菌（Alternaria tenuis）、層出鐮刀菌（Fusarium， prolif-eratum，）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）及澳大利亞平臍孺孢菌（Bipolaris australiensis）。費丹等報道安徽省水稻穗腐病的病原菌主要有層出鐮刀菌（F.proliferatum）、細交鏈格孢菌（A.tenuis）、新月彎孢菌（C.lunata）、稻黑孢霉（Nigrosporaoryzae）。胡頌平等研究發現引起江西地區水稻穗腐病的主要病原菌為厚垣鐮刀菌（F.chlamydosporum）和細極鏈格孢（A.tenuissima），香茅彎孢菌（C.cymbopogonis）和稻黑孢霉（N.oryzae）兩種病原菌也有發生，且病原菌種類分布具有明顯的區域性。馬盾等報道了新疆水稻穗腐病病原菌主要為層出鐮刀菌（F.prolifera-tum），其次為新月彎孢菌（C.lunata）和細交鏈格孢菌（A.tenuis）；在水稻抽穗前5～7天采用50%咪鮮·稻瘟靈可濕性粉劑稀釋1500倍液、25%咪酰胺乳油稀釋1600倍進行噴霧，能夠有效預防該病害的發生。2016—2018年陳利軍等明確了河南信陽水稻穗腐病的病原菌種類主要為鐮孢菌（Fusarium， spp.）、細極鏈格孢（A.tenuissi-ma）、球黑孢菌（N.sphaerica）、稻黑孢霉（N.oryzae）、棒彎孢（C.clavata）、新月彎孢（C.luna-ta）、稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）和草酸青霉（Penicillium， oxalicum）。由于不同地區水稻穗腐病病原菌不同，使得該病害防治十分困難。

本研究對天津水稻主產區穗腐病病原菌進行分離，采用形態學和分子生物學方法對其進行鑒定，并對病原菌的藥劑敏感性進行測定，以期為研究該病原菌的致病機理、病害流行規律奠定基礎，并為該病害的科學防治提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

2020、2021年連續兩年對天津市寶坻區八門城村水稻種植田水稻穗腐病病樣進行采集，田間癥狀表現為水稻潁殼出現褐色斑點，發病嚴重時谷粒干癟、結實率降低、稻米畸形。

1.2病原菌的分離與純化

采用常規組織分離法：將新鮮、發病的水稻穗沖洗干凈，剪取穗潁殼上病健交界處5 mm節段，用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干水分后用鑷子置于含有0.1 g/L氨芐青霉素的PDA培養平板上，放人28℃培養箱培養3～4d，待長出菌絲后進行單孢純化，保存備用。

1.3病原菌分子鑒定

將病原菌接種到PDA培養基中，置于25℃恒溫培養箱中培養。收集菌絲用CTAB法提取總DNA。用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4（ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Es Taq Master Mix（ Dye）25μL，上下游引物各2μL，DNA模板2μL，ddH₂O19μL。擴增程序：94℃4 min;94℃ 30 s，58℃30s，72℃ 50 s，共30個循環；72℃ 10 min。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天津金唯智生物科技有限公司測序。測序結果進行同源性分析。

1.4病原菌室內毒力測定

供試藥劑：95.2%苯醚甲環唑，寧波三江益農化學有限公司：97%戊唑醇，江蘇劍牌農藥化工有限公司：95.3%丙環唑，天津市華宇農藥有限公司；95.1%嘧菌酯，利民化工股份有限公司；98%吡唑醚菌酯，陜西美邦農藥有限公司；95%咯菌腈，北京燕化永樂農藥有限公司：93.4%噻呋酰胺，吉林省八達農藥有限公司；80%代森錳鋅可濕性粉劑，先正達（蘇州）作物保護有限公司；75%三環唑可濕性粉劑，江蘇耘農化工有限公司。

病原菌室內毒力測定采用菌絲生長速率法。配制系列梯度濃度（100、10、1、0.1μg/mL）的含藥PDA平板，以等體積無菌水為對照。將直徑5mm的病原菌菌餅接種到上述平板上，每處理3個重復，恒溫25℃培養4d。采用十字交叉法測定菌落直徑，并計算抑菌率。

抑菌率（%）=（空白對照菌落直徑－藥劑處理菌落直徑）／（空白對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.5數據處理

利用SPSS軟件進行數據處理，計算不同藥劑的毒力回歸方程、相關系數、抑制中濃度（EC₅₀值）等。采用MEGA 5.0軟件對真菌ITS序列進行遺傳分析。

2結果與分析

2.1水稻穗腐病病原菌形態特征

連續兩年病原菌分離結果一致。如圖1所示，分離病原菌在PDA培養基上菌落疏松呈白色，放射狀擴展，后期呈墨綠、灰黑色，最后為黑色。菌絲分隔明顯；分生孢子頂生在一個透明的瓶狀細胞上，近球形，后期呈黑色，大小為（22.7～30.28）μm×（18.2～25.3）μm。

2.2水稻穗腐病病原菌分子鑒定結果

通過對測序結果進行BLAST序列比對發現，分離菌株SDSF與稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）的同源性達100%（圖2），結合菌株形態特征，將菌株鑒定為N.oryzae。

2.3水稻穗腐病的抗性

2020年和2021年兩年稻黑孢霉菌株藥劑敏感性測定結果（表1）顯示，9種殺菌劑中，95%咯菌腈、95.3%丙環唑對對稻黑孢霉抑菌效果最好，2020年ECso值分別為0.2776、1.3102μg/mL，2021年ECso值分別為0.5171、2.0188μg/mL；98%吡唑醚菌酯、93.4%噻呋酰胺對稻黑孢霉抑菌效果較好，且兩個藥劑抑菌效果相當；80%代森錳鋅可濕性粉劑抑菌效果差異較大，2020年EC₅₀值為8.0151μg/mL，2021年EC₅₀值為24.6704μg/mL；95.2%苯醚甲環唑、97%戊唑醇及95.1%嘧菌酯對稻黑孢霉的抑菌效果均較差；75%三環唑可濕性粉劑對稻黑孢霉無抑制作用。

3討論與結論

本研究首次確定引起天津水稻主產區穗腐病的病原菌為稻黑孢霉（N.oryzae），與臺蓮梅、胡頌平、費丹等報道的稻黑孢霉是引起黑龍江、江西、安徽水稻穗腐病的主要病原菌之一結果相一致，今后在生產中應加強稻黑孢霉的監控和防治。除水稻穗腐病外，稻黑孢霉（N.oryzae）還會引起葉斑病、穗梗腐病、鞘枯病。

本試驗中的苯醚甲環唑、戊唑醇、丙環唑、三環唑均為三唑類殺菌劑，能夠抑制孢子萌發和附著孢形成，阻止病菌侵入和減少孢子的產生。稻黑孢霉對丙環唑的敏感性較高，EC₅₀值分別為1.3102μg/mL和2.0188μg/mL；其次為苯醚甲環唑和戊唑醇，兩個藥劑的抑菌效果相當；由于生產中水稻稻瘟病的防治藥劑主要為三環唑，導致該病原菌抗性強，不適宜作為稻黑孢霉引起的水稻穗腐病防治的候選藥劑。嘧菌酯和吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，作用機理主要是通過阻止細胞色素間的電子傳遞，阻止三磷酸腺苷的形成，從而抑制線粒體的呼吸，達到殺菌的作用。本試驗中吡唑醚菌酯對稻黑孢霉的抑菌效果好于嘧菌酯，這可能與生產中藥劑使用頻率相關。咯菌腈為苯基吡咯類殺菌劑，主要通過抑制病原菌葡萄糖磷酰化的轉移，抑制病原菌的正常生長和代謝，導致病菌死亡：同時還能阻礙蛋白質與核酸的合成及細胞正常生物氧化過程，該藥劑對稻黑孢霉抑菌效果顯著，EC₅₀值<1μg/mL，生產中推薦使用。噻呋酰胺是新型的噻唑酰胺類殺菌劑，通過抑制病原真菌三羥酸循環中的琥鉑酸脫氫酶，抑制病原菌的正常生長。代森錳鋅可濕性粉劑為一種廣譜保護性殺菌劑，作用機理為抑制病原菌細胞內丙酮酸氧化。噻呋酰胺與代森錳鋅可濕性粉劑對稻黑孢霉抑菌效果相當。馮愛卿等測定了10種殺菌劑對稻黑孢霉的敏感性，其中10%苯醚甲環唑水分散粒劑、25%吡唑醚菌酯乳油及50%咯菌腈可濕性粉劑對稻黑孢霉菌的抑制效果最好。李戌清等研究發現75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、325g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑、250g/L嘧菌酯懸浮劑對稻黑孢霉菌菌絲生長有較好的抑制作用。

綜上，咯菌腈和丙環唑對稻黑孢霉抑菌效果最好，其次為吡唑醚菌酯和噻呋酰胺，該4種殺菌劑均可作為生產中防治稻黑孢霉的候選藥劑。80%代森錳鋅可濕性粉劑兩年的抑菌效果差異較大。苯醚甲環唑、戊唑醇及嘧菌酯由于在生產中使用較為頻繁，效果略差；75%三環唑對稻黑孢霉無抑制作用。本試驗為天津地區由稻黑孢霉引起的水稻穗腐病的防治提供了一定的科學依據。