珍稀野生大王杜鵑根際土壤細菌群落結構分析

李婧　劉海燕　蒙文萍　周穎　楊朔　周艷

關鍵詞：大王杜鵑：根際土壤：細菌群落結構：高通量測序

中圖分類號：S685.21：Q938.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）03-0095-06

杜鵑屬（Rhododendron L.）是杜鵑花科（Eri-caceae）最大的一個屬，杜鵑屬植物通常被稱為杜鵑花，目前全世界約有千余種，廣泛分布于亞洲、歐洲和北美洲，主產東亞和東南亞地區。我國擁有最為豐富的野生杜鵑花資源，西南地區更是杜鵑花多樣化和多度中心，約有410種，但由于分布狹窄、生境遭受破壞、種群繁衍困難等原因，部分種類的野生杜鵑花資源日益稀缺。大王杜鵑（Rhododendron rex）是野生杜鵑花中較為珍稀的一種，僅分布在西南地區海拔2300～3300米的山坡林中，是我國特有的珍稀原始古老物種，被《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》和《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》列為易危（vulnerable）等級，《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物》中被收錄為國家Ⅱ級保護植物。珍稀瀕危植物的遺傳學研究一直是討論熱點，相關研究有助于深層次了解物種進化史和瀕危機制，進而有效保護瀕危物種，但物種的遺傳變異不僅與類群分布有關，還受類群的起源、進化、生物學特性及生境條件等因素影響，所以相關研究需要建立在對珍稀瀕危物種生境條件充分了解的基礎上。

土壤是植物生境的重要組成部分，土壤微生物是生態系統的主要分解者，對土壤質量的改良和養分循環的促進具有重要作用。根際是植物根系周圍受根系生長影響的土體，是微生物與宿主植物之間發生相互作用的一個微小區域，在這個微小區域中蘊含著豐富的微生物資源。細菌則是這些微生物資源中數量最多、種類最豐富的類群，有些細菌可以促進植物生長、防治病害，被稱為根際促生菌（PGPR），有些則會抑制植物的正常生長。為了探明大王杜鵑生長與其根際土壤細菌之間的互作關系，本研究選取野生大王杜鵑根際土壤作為研究對象，采用高通量測序（Illumina MiSeq）技術對土壤細菌16S rRNA的V3-V4區片段進行測序，擬從分子水平揭示野生大王杜鵑根際土壤細菌群落結構，為今后開展大王杜鵑的根際促生菌分離篩選、人工培育及瀕危機制研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集

土壤樣品于2021年4月采自云南轎子山國家級自然保護區（102°49′56″E，26°4′7″N）。以野生大王杜鵑植株生長點為中心，分別采集5～10、10～15、15～20 cm深度范圍的土壤，去除根系外圍土壤后采用抖落法輕輕抖落須根上4 mm的土壤作為樣品，一個深度范圍為一個樣品，共3個樣品，分別裝入無菌自封袋，標記為DW-10 cm、DW-15 cm、DW-20 cm，干冰保存，帶回實驗室后置于-80℃低溫冰箱中保存，備用。

1.2根際土壤細菌基因組DNA提取、擴增與測序

采用OMEGA土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A^TMMag-Bind Soil DNA Kit）提取樣品總DNA，具體操作方法參照試劑盒說明書。

PCR擴增分兩輪進行，以提取到的樣品總DNA為模板進行第一輪PCR擴增，采用上游引物341F（5′- CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和下游引物805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）擴增細菌16S rRNA的V3-V4區片段，PCR擴增反應體系（30μL）：2xHieff Robust PCR Master Mix 15μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板1μL，加水至30μL。擴增程序；94℃3 min；940C 30 s，45℃ 20 s，65℃30 s，循環5次；94℃20s，55℃20 s，72℃ 30 s，循環20次；72℃5 min，19℃保溫：以第一輪PCR產物作為模板，用P5（5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3′）和P7（5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3′）引物進行第二輪擴增，反應體系（30μL）：2×Hieff Robust PCR Master Mix 15μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，加水至30μL。擴增程序：95℃3 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，循環5次；72℃5 min，10℃保溫。

經過兩輪PCR擴增后的產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后由生工生物工程（上海）股份有限公司采用Illumina MiSeq二代測序平臺進行高通量測序

1.3數據處理與分析

通過高通量測序獲得的原始測序序列經FLASH和和Trimmomatic軟件進行拼接和質量過濾后，再經Usearch和UCHIME去除非擴增區域序列和嵌合體序列，最終獲得高質量有效序列。使用QIIME軟件將各樣品的全部有效序列進行聚類，相似閾值≥97%的序列聚類為一個操作分類單元（OTU） ，并使用Mothur軟件進行細菌群落多樣性分析。使用FAPROTAX數據庫預測根際土壤細菌功能，Microsoft Excel 2007軟件處理數據及制作圖表。

2結果與分析

2.1根際土壤DNA的提取

提取結果表明，DNA條帶清晰明亮，說明提取片段完整，可用于后續分析。使用Qubit 3.0熒光定量儀對DNA濃度進行測定，3個樣品的DNA濃度分別為41.6、26.6、28.4 ng/μL，濃度適宜，可滿足后續試驗要求。

2.2根際土壤測序結果

通過對各樣品細菌16S rRNA的V3-V4區片段進行高通量測序，共獲得原始序列235 331條，質控后得到有效序列230 150條，基于≥97%的相似閾值對有效序列進行聚類后共獲得958個OTU，各樣品測序結果見表1。使用OTU稀釋曲線對樣品測序數據量是否合理進行評估，結果（圖1）表明，各樣品OTU稀釋曲線均逐漸趨于平緩，說明此次測序數據量合理，物種分布均勻，能夠反映大王杜鵑根際土壤細菌群落物種多樣性。

2.3根際土壤細菌群落Alpha多樣性

Chao 1指數和ACE指數表征細菌群落的豐度大小，數值越大表明樣品中物種種類越多；Shannon指數和Simpson指數表征細菌群落的多樣性高低，Shannon指數越大、Simpson指數越小表明樣品中物種多樣性越高。由表2可知，DW-20 cm樣品的Shannon指數、Chao 1指數和ACE指數均最大，說明15～20 cm深度范圍的大王杜鵑根際土壤細菌群落豐度和多樣性最大。

2.4根際土壤細菌群落組成

通過對各樣品細菌16S rRNA的V3-V4區片段進行高通量測序并聚類后，共獲得958個OTU，隸屬于19門54綱83目140科188屬。從門分類水平來看（圖2a），大王杜鵑根際土壤優勢細菌類群主要分屬于6個門，占比89.67%，依次為變形菌門（Proteobacteria，38.47%）、酸桿菌門（Ac-idobacteria，24.87%）、放線菌門（Actinobacteria，13.90%）、浮霉菌門（Planctomycetes，7.57%）、綠彎菌門（Chloroflexi，2.58%）、疣微菌門（Verru-comicrobia，2.28%）。

從綱分類水平來看（圖2b），相對豐度大于1%的共有12個，占比86.73%，依次為α-變形菌綱（Al-phaproteobacteria，30.78%）、放線菌綱（Actinobacteria，13.78%）、酸桿菌綱亞群2（Acidobacteria Gp2，8.96%）、浮霉菌綱（Planctomycetia，7.56%）、酸桿菌綱亞群1（Acidobacteria Gpl，7.43%）、酸桿菌綱亞群3（Acidobacteria Gp3，4.89%）、γ-變形菌綱（Gamma-proteobacteria，4.50%）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria，2.40%）、酸桿菌綱亞群6（Acidobacteria Gp6，1.99%）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria，1.65%）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，1.49%）、斯巴達桿菌綱（Sparto-bacteria，1.30%）。

從目分類水平來看（圖2c），相對豐度大于1%的共有16個，占比82.38%，其中相對豐度較大的8個目依次為根瘤菌目（Rhizobiales，22.50%）、Norank Acidobacteria Gp2（8.96%）、浮霉菌目（Planctomycetales，7.50%）、Norank AcidobacteriaGpl（7.43%）、放線菌目（Actinomycetales， 7.29%）、紅螺菌目（ Rhodospirillales，6.41%）、Norank Ac-idobacteria Gp3 （4.89%）、酸微菌目（Acidimicrobi-ales，3.46%）。

從科分類水平來看（圖2d），相對豐度大于1%的共有21個，占比76.48%，其中相對豐度較大的8個科依次為Unclassified Rhizobiales（11.67%）、Norank Acidobacteria Gp2（8.96%）、浮霉菌科（Planctomycetaceae，7.50%）、Norank Ac-idobacteria Gpl（7.43%）、慢生根瘤菌科（Bradyrhi-zobiaceae， 4.96%）、Norank Acidobacteria Gp3（4.89%）、Unclassified Rhodospirillales（3.22%）、Roseiarcaceae（3.14%）。

從屬分類水平來看（圖2e），相對豐度大于1%的共有21個，占比72.99%，其中相對豐度較大的8個屬依次為Unclassified Rhizobiales（11.67%） 、Gp2（8.96%）、Unclassified Planctomyc-etaceae（6.67%）、Gp1（6.61%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，4.96%）、Gp3（3.28%）.Unclassi-fied Rhodospirillales（3.22%）、Roseiarcus（3.14%）。

2.5根際土壤細菌群落功能預測

使用FAPROTAX對大王杜鵑根際土壤細菌群落功能注釋后共獲得24個功能種群分組，其中，相對豐度大于0.1%的有13個，占總豐度的20.28%；其他（Other）功能種群相對豐度小于0.1%，占總豐度的79.720/00 13個相對豐度大于0.1%的功能種群中，化能異養（Chemoheterotro-phy）、需氧化能異養（Aerobic chemoheterotrophy）和固氮作用（Nitrogen fixation）種群的相對豐度最大，均大于1%；其余10個功能種群的相對豐度均小于1%，依次為細胞內寄生物（Intracellular para-sites）、發酵作用（Fermentation）、硝酸鹽還原（Ni-trate reduction）、尿素分解（Ureolysis）、硝化作用（Nitrification）、需氧亞硝酸鹽氧化（Aerobic nitrite oxidation）、動物寄生或共生體（Animal parasites or symbionts）、人類病原體（Human pathogens all）、芳香族化合物降解（Aromatic compound degrada-tion）、葉綠體固氮（Chloroplasts，圖3）。

3討論與結論

土壤微生物是影響生態系統的重要因子，細菌作為土壤微生物中的主要菌種，其群落結構特征是土壤微生態系統發生變化的敏感響應，也是衡量土壤質量和生態系統穩定的關鍵因素，對植物的致瀕機制和保護有著重要意義。本研究采用高通量測序技術對珍稀野生大王杜鵑根際土壤細菌群落進行測序和分析，初步獲得大王杜鵑根際土壤細菌在門、綱、目、科、屬分類水平上的優勢類群、功能種群分組及相對豐度。測序共獲得有效序列230 150條，基于≥97%的相似閾值對有效序列進行聚類后獲得958個OTU，隸屬于19門54綱83目140科188屬，其中，優勢菌門為變形菌門（ Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacte-ria）、放線菌門（Actinobacteria）等6個門，變形菌門相對豐度最高，達38.47%，與殷根深等[22]對銹紅毛杜鵑（Rhododen，dron， bureavii）、乳黃杜鵑（R.lacteum）和亮鱗杜鵑（R.heliolepis）、方敏等對馬纓杜鵑（R.delavayi）、趙帆等對草莓（Fra-garia ananassa）、周強等對雙蕊蘭（Dipland-rorchis sinica）的研究結果一致，但不同植物在門分類水平以下的優勢菌群存在明顯差異，這充分體現了不同植物根際土壤細菌群落豐富的多樣性，既有相似的優勢菌群，也有各自獨特的菌群。

通過研究發現，大王杜鵑根際土壤細菌生態功能以化能異養、需氧化能異養和固氮作用為主，相對豐度分別為6.98%、6.65%和4.31%。已有研究表明，化能異養和需氧化能異養功能是廣泛的生態系統功能，更是與碳循環相關的重要生態功能，由變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Ac-idobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）等微生物參與執行。變形菌門下有許多可以促進植物生長和進行固氮作用的促生根際菌，例如，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）可以促進植物生長以及種子萌發，慢生根瘤菌屬（Bradyrhi-zobium）和根微菌屬（Rhizomicrobium，）都具有固氮作用，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）對植物生長不僅具有促進作用，還能抑制病害。本研究在大王杜鵑根際土壤細菌群落中檢測到的鞘氨醇單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、根微菌屬和伯克霍爾德菌屬的相對豐度分別為0.03%、4.96%、0.23%和0.08%，其中，慢生根瘤菌屬相對豐度較大，極有可能為大王杜鵑的生長發育提供氮素營養，其余3屬的相對豐度較小，是否具有上述生物學功能還需深入探究。此外，本研究在序列分析中發現存在部分未分類細菌（Unclassified Bacteria），這些菌種資源有待采用其它分析手段進一步挖掘和研究。

本研究采用高通量測序技術對珍稀野生大王杜鵑根際土壤細菌群落進行測序和分析，從分子水平揭示了大王杜鵑細菌群落結構，為今后開展大王杜鵑根際促生菌的分離篩選、人工培育及瀕危機制研究奠定了基礎。