小麥DREB4蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

李永波　魯琳　方會見　崔德周　孟福燕　黃琛　隋新霞　樊慶琦　楚秀生

關鍵詞：小麥：非生物脅迫：DREB4轉錄因子：多克隆抗體

中圖分類號：S512.1：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023） 03-0009-06

干旱、鹽、高溫、冷等各種非生物脅迫會嚴重影響小麥產量。DREB蛋白含有一個保守的AP2結構域，可以和順式作用元件DRE核心序列（A/GCCGAC）發生特異性結合，通過在轉錄水平上調控下游基因的表達，進而應對各種非生物脅迫。到目前為止，DREB轉錄因子在擬南芥、大豆、水稻、玉米、大麥和小麥等多種植物中被鑒定出來。DREB分為六大類（DREB1～6），其中，DREB1在擬南芥、水稻、玉米中主要應答冷脅迫，DREB2主要應答干旱、鹽脅迫，DREB3參與ABA和糖信號途徑，DREB4應答干旱、冷脅迫及在乙烯與茉莉酸途徑中起作用，DREB5參與應答干旱、冷脅迫，DREB6應答干旱、鹽脅迫。大量研究已驗證了DREB在植物應對非生物脅迫中的功能。如在小麥中過表達擬南芥DREBIA、大豆GmDREB1或棉花Gh DREB基因，可通過提高根系活力、光合作用及滲透調節能力提高小麥的抗旱性；在擬南芥中過表達大豆GmDREB2、GmDREB3或小麥Ta DREB3基因，可提高擬南芥抗旱、耐鹽、耐高溫及抗凍性；過表達GmDREB6基因，可增強大豆的耐鹽能力。

然而，目前幾乎所有關于DREB的研究是集中在轉錄水平上的調控，缺乏蛋白質水平上的調控研究，且DREB蛋白發揮生物學功能是否通過磷酸化、乙酰化等蛋白水平上的調控尚未可知，因此，研究識別內源性DREB蛋白的特異性多克隆抗體，對于DREB在蛋白水平的調控研究具有非常重要的意義。

本研究通過對小麥中已有的DREB4A、4B和4C進行序列分析，選取DREB4A進行原核表達、純化，并以其作為抗原，首次制備出可識別小麥內源DREB4蛋白的多克隆抗體，以期為進一步研究植物DREB4在蛋白水平上的調控機理提供方法學基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試小麥品種為濟麥379，由山東省審定（魯審麥20210017）。取其幼苗期根、葉為材料進行試驗。

1.2 DREB4序列分析與合成

本研究通過DNAMAN8軟件對NCBI中提交的DREB4A（AY781354.1）、4B（AY781355.1）和4C（AY781356.1）序列進行分析；DREB4A序列的合成由北京擎科生物科技有限公司進行。

1.3 DREB4A載體構建、原核表達及純化

將上述合成的DREB4A序列與大腸桿菌表達載體PET30a通過同源重組的方法（pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，CU201-02，北京全式金生物技術股份有限公司）連接，將連接產物轉入DH5α（北京擎科生物科技有限公司）感受態細胞中，冰上放置15 min.42℃水浴熱激90s，再冰上放置2 min，加入1 mL無任何抗生素的LB液體培養基，37℃、210r/min水平搖th，然后取100μL菌液，涂于含有卡那霉素的LB固體培養基上，37℃過夜培養。挑取10個單克隆進行PCR檢測，選取2個陽性信號最強的單克隆由北京擎科生物科技有限公司進行測序，對測序正確的單克隆進行搖菌、質粒提取（質粒小提試劑盒，DP103，北京天根生化科技有限公司）。將提取好的質粒轉入B121（ DE3）感受態細胞（CD701-02，北京全式金生物技術股份有限公司）中，剩余步驟同DH5a感受態細胞轉化。挑單克隆，置于5 mL LB液體培養基中，37℃過夜培養，然后吸取1 mL菌液，加入到300 mL LB液體培養基中進行擴大培養，待菌液OD值為0.6～0.8時，加入終濃度為50 mmol/L的IPTG（G5042-1G，武漢塞維爾生物科技有限公司）進行誘導表達，28℃過夜培養；菌液于6000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用1×PBS（ phosphate buffer saline）清洗沉淀1次，然后加入40 mL lxPBS重懸，超聲破碎（開3s，關3s；共計30 min），6000 r/min離心10min，分別將沉淀、上清液進行SDS電泳檢測。利用His標簽蛋白純化試劑盒（P2226，上海碧云天生物技術有限公司）對上清液進行純化，然后置于透析袋中4℃過夜透析，將透析后的蛋白置于-20℃保存備用。

1.4小麥DREB4多克隆抗體制備

選取實驗級日本大耳白兔和新西蘭大白兔各1只，飼養體重至1～2 kg時，用注射器將充分混勻的1mL完全弗氏佐劑（液體石蠟：羊毛脂=2：1）和0.3 mg DREB4A融合蛋白對每只兔子進行皮下注射第1針，標記為第1天；第12天，將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑（完全弗氏佐劑+終濃度20 mg／mL的卡介苗）和0.15 mg融合蛋白對每只兔子進行皮下注射第2針；第26天，將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑和0.15 mg融合蛋白對每只兔子進行肌肉注射第3針；第40天，將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑和0.15 mg融合蛋白對每只兔子進行肌肉注射第4針：第53天，取兔子血清進行Western blot驗證。

1.5 Western blot分析

利用植物組織蛋白裂解液提取小麥幼苗期根、葉部的總蛋白（植物蛋白提取試劑盒，CW0885，康為世紀生物技術有限公司），配制15%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳：通過濕法轉膜，將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素薄膜上，然后將膜放人含有2%脫脂奶粉的TBS（25 mmol/LTris-HCl，137 mmol/L NaCl）中，封閉1h；加入DREB4多克隆抗體（1：1000稀釋于2%脫脂奶粉中），4℃過夜；用TBST（TBS+20%吐溫-20）洗滌3次后，向封閉液中加入堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）標記的二抗，緩慢搖動24 h，然后TBST洗滌3次，每次10 min;最后用發色液（TBS 10 mL，5% NBT 45μL，5% BCIP 35μL）進行發色。

1.6免疫組織化學法進行亞細胞定位

將小麥葉片下表皮撕下，置于4%多聚甲醛中，室溫放置24 h，棄掉多聚甲醛，用1×PBS清洗3次，加入2%脫脂奶粉于37℃封閉30 min，然后在4℃下加入DREB4多克隆抗體（1：200稀釋于2%脫脂奶粉中）過夜；用PBS洗滌3次后，加入1μL二抗（山羊抗兔-Alexa Fluor 555抗體）和10mL BSA，37℃繼續孵育th，然后用TBS清洗3次，在室溫下用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DA-PI，AnaSpec Inc.， San Jose， CA，USA）染色10 min，然后用TBS清洗3次，置于熒光顯微鏡（HT7700，Hitachi，Tokyo，Japan）下觀察并拍照。

2結果與分析

2.1小麥DREB4序列分析

在普通小麥中，DREB4存在DREB4A、4B、4C三種轉錄本，其中，DREB4A編碼394個氨基酸，分子量為42.8 kDa；DREB4B編碼346個氨基酸，分子量為37.7 kDa；DREB4C編碼68個氨基酸，分子量為7.1 kDa（圖1）。三個蛋白氨基酸序列的保守性為61.28%，第1～25位的氨基酸完全一致，其中，DREB4B除第26～73位氨基酸缺失外，其它位置的氨基酸與DREB4A完全一致。DREB4A、4B和4C存在序列間的差異，可能是應對不同非生物脅迫產生的可變剪切所致。

2.2小麥DREB4A的原核表達

鑒于DREB4A的氨基酸序列最長，選其進行后續分析。首先，將人工合成的DREB4A序列與表達載體PET30a連接后，在大腸桿菌中進行表達，上清液中的蛋白純化后進行SDS -PAGE檢測。結果顯示，在大約50 kDa處出現清晰的蛋白條帶（圖2），與預期的蛋白分子量相符，表明DREB4A成功表達。

2.3 DREB4多克隆抗體的制備

本研究以上述獲得的純化DREB4A融合蛋白為抗原免疫兔子，從兔血清中獲取了DREB4多克隆抗體。Western blot結果顯示，該抗體在目的蛋白位置清楚地識別到DREB4A蛋白（圖3）。

2.4 DREB4多克隆抗體對小麥內源性DREB4蛋白的識別及特異性檢測

為了進一步驗證該抗體能否識別小麥內源性DREB4蛋白，分別提取小麥苗期根、葉總蛋白進行免疫識別。Westem blot結果顯示，僅在37 kDa處檢測到清晰的蛋白條帶，這與預測的DREB4B蛋白分子量一致（圖4）。表明該抗體可以識別小麥內源性DREB4B蛋白，而且特異性好，可以用于后續植物DREB分子機理的相關研究。

2.5 DREB4亞細胞定位分析

DREB4定位于細胞核中（圖5），與前人報道的DREB轉錄因子核定位的結果一致，進一步證實了該抗體特異性較好，可用于開展免疫組織或細胞化學研究的可行性。

3討論與結論

DREB是一類抗非生物脅迫的轉錄因子，目前主要用于抗逆轉基因植物的培育及相關分子機理的解析。小麥DREB4蛋白是一種對動物和人類無危害的蛋白，將其用于糧食作物抗逆性轉基因改良有著廣闊的市場前景。DREB4在小麥中存在三種轉錄形式（DREB4A、4B和4C），其中，DREB4A編碼的多肽鏈最長，涵蓋的蛋白信息最豐富，推測由此蛋白作為抗原產生的抗體可識別DREB4的所有三種形式，因此本研究利用DREB4A蛋白作為抗原，進行了DREB4多克隆抗體的制備。經過抗原上清蛋白的純化、免疫注射，最終研制出能識別小麥內源性DREB4蛋白的多克隆抗體。

盡管從植物中已克隆出多種類型的DREB基因，但由于其抗體類型匱乏以及識別內源性蛋白抗體的空白，導致有關DREB在蛋白水平上的調控機理研究進展相對緩慢。目前，只有擬南芥DREBIA的抗體制備成功，且僅對大腸桿菌中表達的擬南芥DREBIA融合蛋白進行了檢測。本研究首次開發了特異性識別小麥內源DREB4蛋白的多克隆抗體，既豐富了植物DREB的抗體類型，也為進一步推動DREB在蛋白水平上的研究提供了方法學基礎。

利用本研究制備的DREB4多克隆抗體檢測小麥苗期根、葉內源性DREB4蛋白時，僅識別到了DREB4B蛋白條帶，與預測的該抗體能識別小麥中DREB4三種蛋白形式的結果不一致，這可能是因為DREB4具有組織器官以及不同發育階段表達特異性，在小麥苗期根、葉中主要以DREB4B的形式表達，而在花、籽粒等其它組織器官以及不同發育階段中則以其它形式表達；另外，DREB4在不同小麥品種中的表達形式也可能存在一定的差異，本研究所用小麥品種濟麥379為抗旱節水型品種，在其苗期根、葉中主要以DREB4B的形式表達，但在其它類型的小麥品種中以哪種形式表達還有待進一步研究。

傳統DREB基因亞細胞定位是采用構建DREB-GFP過表達載體轉入組織或細胞中的方法進行定位，而本研究是利用該抗體對內源DREB4進行免疫定位，與傳統方法相比可避免因過表達造成目的蛋白移位的現象。

綜上所述，本研究通過對DREB4A進行大腸桿菌表達、純化，并以此作為抗原成功制備出可識別小麥內源性DREB4蛋白的高度特異性多克隆抗體，可為深入研究植物DREB4在蛋白水平上參與非生物脅迫的調控機理奠定方法學基礎。