多芯片聯合藥物靶點基因探討骨關節炎患者滑膜中生物標志物和治療靶點

陳莉華　曾平　陳財　黃悅　陸冠宇　熊波　劉金富

【摘 要】目的：探索骨關節炎滑膜組織中的差異基因和相關通路，尋找骨關節炎的關鍵基因，闡明骨關節炎的發病機制。方法：從GEO數據庫中收集4個相關數據集，分別是GSE1919、GSE32317、GSE41038和GSE82107，包括37個骨關節炎滑膜組織樣本和16個正常滑膜組織樣本，鑒定出差異表達基因（DEGs）。對這些DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用Cytoscape軟件構建DEGs的蛋白質相互作用（PPI）網絡，篩選Degree前10位的基因。通過Drugbank數據庫篩選獲準的用于治療骨關節炎的藥物，Drug Gene Interaction數據庫挖掘這些藥物的靶基因。利用微生信在線作圖工具將藥物靶基因和PPI Degree前10位的基因取交集，獲得藥物靶基因與PPI Degree前10位基因相同的基因靶點。最后，再利用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）對臨床樣本檢測評估關鍵基因的基因表達量。結果：總共鑒定出68個DEGs，包括29個上調的DEGs（MRC2、CDH11、HK3等）和39個下調的DEGs（ADH1B、APOD、ADIPOQ等）。其功能主要富集在皮質類固醇的反應、血液循環、氧化還原酶活性和冷誘導產熱的正向調節過程，以及IL-17信號通路、PPAR信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和糖酵解。PPI Degree前10位的基因分別是LEP、MMP-9、FOS、CXCL10、MMP-1、TNFSF11、ADIPOQ、FABP4、LPL和MMP-3。通過Drugbank數據庫和Drug Gene Interaction數據庫共挖掘出30種獲得批準的治療骨關節炎藥物及對應的284個靶基因。利用微生信在線作圖工具，獲得治療骨關節炎藥物靶基因與PPI Degree前10位的基因交集為MMP-9、LPL和MMP-1。定量逆轉錄聚合酶鏈反應結果顯示，MMP-9在骨關節炎患者滑膜中呈高表達，且差異有統計學意義（P < 0.01）；LPL在骨關節炎患者滑膜中呈低表達，且差異有統計學意義（P < 0.05）。結論：LPL和MMP-9是用于治療骨關節炎的有效分子靶標。

【關鍵詞】 骨關節炎；滑膜組織；微陣列芯片；生物標志物；靶點基因

Study on Biomarkers and Therapeutic Targets in Synovium of Patients with Osteoarthritis by Multi Chip Combined with Drug Target GeneCHEN Li-hua，ZENG Ping，CHEN Cai，HUANG Yue，LU Guan-yu，XIONG Bo，LIU Jin-fu

【ABSTRACT】Objective：To explore the differential genes and related pathways in the synovium of osteoarthritis，find the key genes of osteoarthritis，and clarify the pathogenesis of osteoarthritis.Methods：Four related data sets were collected from GEO database，namely GSE1919，GSE32317，GSE41038 and GSE82107，including 37 synovial tissue samples of osteoarthritis and 16 normal synovial tissue samples，and differential expression genes（DEGs）were identified.GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were carried out for these DEGs，and protein interaction（PPI）network of DEGs was constructed using software Cytoscape to screen the top 10 genes of Degree.The Drugbank database was used to screen approved drugs for the treatment of osteoarthritis，and the Drug Gene Interaction database was used to mine the target genes of these drugs.The drug target gene and the top 10 genes of PPI Degree were intersected by using the online mapping tool of Bioinformatics to obtain the same gene target of the drug target gene and the top 10 genes of PPI Degree.Finally，quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR）was used to detect and evaluate the gene expression of key genes in clinical samples.Results：A total of 68 DEGs were identified，including 29 up regulated DEGs（MRC2，CDH11 and HK3）and 39 down regulated DEGs（ADH1B，APOD and ADIPOQ）.Their functions are mainly concentrated in the positive regulation process of corticosteroid response，blood circulation，oxidoreductase activity and cold induced thermogenesis，as well as IL-17 signal pathway，PPAR signal pathway，tumor necrosis factor signal pathway and glycolysis.The first 10 genes of PPI Degree are respectively LEP，MMP-9，FOS，CXCL10，MMP-1，TNFSF11，ADIPOQ，FABP4，LPL and MMP-3.Through the Drugbank database and the Drug Gene Interaction database，a total of 30 approved drugs for the treatment of osteoarthritis and their corresponding 284 target genes were mined.Using the online mapping tool of Bioinformatics，the intersection（MMP-9，LPL and MMP-1）of the drug target gene for osteoarthritis and the top 10 genes of PPI Degree were obtained.Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction showed that MMP-9 was highly expressed in synovium of patients with osteoarthritis，and the difference was statistically significant（P < 0.01）;LPL was expressed low in synovium of patients with osteoarthritis，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.Conclusion：LPL and MMP-9 are effective molecular targets for the treatment of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;synovial tissue;microarray chip;biomarkers;target gene

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的與年齡相關的致殘性疾病，通常涉及關節軟骨、滑膜、軟骨下骨、韌帶、包膜和關節周圍肌肉的結構改變［1］。隨著病情的發展，患者最終會出現關節疼痛、腫脹、僵硬和行動受限，目前臨床治療只能對癥處理，尚無有效的早期干預措施阻止病情發展［2］，因此，尋找OA的關鍵基因，闡明其發病機制是迫切需要的。

滑膜是覆蓋關節囊表面的一種疏松結締組織，最近研究發現，滑膜與OA的發生和發展密切相關［3-5］。研究人員認為，滑膜促炎介質是誘導OA發病的重要因素［6］，可能通過促進軟骨退化發生作用［7］。

通過整合、分析來自不同平臺的基因表達譜，有助于擴大樣本量，從而更準確地探索OA的發病機制和關鍵基因。本研究從基因表達綜合數據庫（GEO）下載了4個系列矩陣文件（包括GSE1919、GSE32317、GSE41038和GSE82107），其中有37個OA滑膜組織樣本和16個健康對照者的滑膜組織樣本。鑒定OA和健康對照者之間的差異表達基因（DEGs），并對DEGs進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。然后構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，將治療OA的藥物靶基因和PPI Degree前10位的基因取交集，獲得治療OA藥物靶基因與PPI Degree前10位基因相同的基因靶點。最后，利用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）對臨床樣本檢測評估關鍵基因的基因表達量。本研究試圖獲得對OA分子通路的更多見解，并為OA治療確定更多潛在的靶基因。

1 資料和方法

1.1 資料來源 使用關鍵詞“osteoarthritis”，從公共數據庫GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）上搜索微陣列數據集，下載OA滑膜相關芯片數據集GSE1919、GSE32317、GSE41038和GSE82107，見表1。共計納入OA滑膜組織（OA組）37例，正常滑膜組織（正常組）16例。

1.2 分析方法

1.2.1 數據處理 利用R語言軟件（版本3.4.3，http：//www.r-project.org/）中的Perl軟件（https：//www.perl.org/）將從GEO數據集下載的原始數據的探針名轉換成基因名，獲得整合的基因表達矩陣。然后再利用實驗室Limma軟件包（http：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html）和Sva包（http：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/sva.html）對數據進行分析。

1.2.2 DEGs篩選 R語言軟件中Limma包是為檢查DEGs而設計。設定P < 0.05和|log₂FC（fold change）|≥1作為閾值。差異結果用熱圖及火山圖進行可視化呈現。

1.2.3 GO和KEGG功能富集分析 GO是高通量基因組或轉錄組數據的一種常用方法，用于識別基因表達調控系統的特征生物學功能。生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）是GO分析的三大組成部分。KEGG是一個系統分析基因功能的知識庫，將基因組信息與高階功能信息聯系起來。在實驗中，基于g：Profiler工具進行了GO富集分析和KEGG途徑富集分析。篩選條件設定g：SCS < 0.05作為閾值。

1.2.4 PPI網絡構建及關鍵基因篩選 蛋白質之間的功能相互作用可以為細胞加工的分子機制提供背景。STRING在線數據庫（https：//string-db.org/）是檢索相互作用基因的搜索工具，其可以構建DEGs的PPI網絡［12］。在本研究中，使用STRING在線數據庫，導出最低可信度“combined score > 0.7”的分析結果。之后將網絡數據通過Cytoscape繪制差異基因的PPI網絡模型。利用CytoHubba插件計算PPI網絡中每個節點的Degree值。Degree值大的蛋白被認為是網絡中的關鍵蛋白。

1.2.5 治療OA藥物和靶基因的鑒定 Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）是一個提供有關藥物、藥物靶標、藥物作用和藥物相互作用詳細信息的在線網站。以“osteoarthritis”為關鍵詞，收集治療OA的獲得批準的藥物。在Drug Gene Interaction數據庫（http：//www.dgidb.org/）中確定了所選藥物的靶標。然后將治療OA的藥物靶基因與PPI Degree前10位的基因利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖工具取交集，獲得治療OA的藥物靶基因與PPI Degree前10位的基因相同的基因靶點。

1.2.6 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）驗證 為了證實生物信息學分析的結果，收集4例OA患者和4例無OA患者的滑膜組織用于qRT-PCR驗證。該研究方案經廣西中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。采用TRIzol試劑提取滑膜組織中的總RNA，將來自總RNA的RNA樣品反轉錄為cDNA，然后采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，美國）進行qRT-PCR，GAPDH作為內參。使用2-ΔΔCt方法計算相對mRNA表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 差異基因鑒定 根據矯正后的P < 0.05和|log₂FC（fold change）|≥1作為標準，與正常組相比，從OA組中總共獲得68個DEGs，包括29個上調的DEGs和39個下調的DEGs。差異結果采用熱圖及火山圖進行可視化表達，見圖1。

2.2 DEGs的GO、KEGG富集分析 GO富集分析表明，在MF中，DEGs在乙醇脫氫酶活性、視黃醇脫氫酶活性、氧化還原酶活性，膠原結合、環磷酸腺苷依賴性蛋白激酶調節劑活性豐富。在BP中DEGs主要參與對皮質類固醇的反應、血液循環、氧化還原酶活性和冷誘導產熱的正向調節過程。此外，CC中的DEGs主要富集細胞外區域、細胞外空間、細胞外小泡和細胞外細胞器。KEGG通路富集結果表明，DEGs富集在IL-17信號通路、PPAR信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和糖酵解。見圖2。

2.3 DEGs的PPI網絡分析 本次實驗構建的PPI網絡由26個節點和35條線組成，見圖3（1）。度中心性定義為相鄰鏈接的數量，也就是將一種蛋白質與其相鄰蛋白質相互作用的次數，是網絡理論中的基本參數，用于評估網絡中的節點，DEGs的Degree得分如圖3（2）所示，瘦素（LEP，Degree = 14），基質金屬蛋白酶-9（MMP-9，Degree = 14），核磷蛋白（FOS，Degree = 12），C-X-C基序趨化因子-10（CXCL10，Degree = 8），基質金屬蛋白酶-1（MMP-1，Degree = 8），脂肪壞死因子配體超家族成員11（TNFSF11，Degree = 8），脂聯蛋白（ADIPOQ，Degree = 6），脂肪酸結合蛋白酶4（FABP4，Degree = 6），脂蛋白酯酶（LPL，Degree = 6）和基質金屬蛋白酶-3（MMP-3，Degree = 6）是該網絡中排名前10的關鍵基因。

2.4 治療OA藥物和相關靶基因的挖掘 通過Drugbank數據庫篩選出30種獲得批準的治療OA的藥物，在Drug Gene Interaction數據庫共挖掘出這些藥物對應的284個靶基因，見表3。治療OA的藥物及其靶標基因的網絡圖見圖4。MMP-9、LPL和MMP-1是治療OA相關藥物的靶基因和DEGs PPI Degree前10位基因的交集基因，見圖5。

2.5 關鍵基因的驗證 為了驗證微陣列的結果，用qRT-PCR系統檢測相同基因的表達水平。統計結果顯示，與對照組相比，OA組中LPL下調，差異有統計學意義（P < 0.05）；MMP-9上調，差異有統計學意義（P < 0.01）。見圖6。

3 討 論

OA是全球致殘的主要原因之一，由于發病機制尚不清楚，對疾病預防和早期治療仍具挑戰性［13］。近年來，微陣列技術被廣泛用于預測OA的潛在診斷和治療靶點，有望成為早期診斷和探索疾病治療靶標的有效工具［14］。在本研究中，基因表達譜GSE1919、GSE32317、GSE41038和GSE82107從GEO數據庫下載，包括37個OA滑膜樣品和16個正常滑膜樣品。與正常組相比，在OA組的滑膜組織中鑒定出68個DEGs，包括29個上調的DEGs和39個下調的DEGs。這些DEGs可能與OA有關，并且可能用作潛在的藥物靶標。通過GO和KEGG富集分析，進一步了解它們的調控機制。使用STRING數據庫挖掘DEGs之間的相互關系，構建PPI網絡進一步研究DEGs在蛋白質水平上的相互作用。Drugbank數據庫和Drug Gene Interaction數據庫共挖掘出30種獲得批準的治療OA藥物及對應的284個靶基因，其中MMP-9、LPL、MMP-1是治療OA藥物的靶基因和DEGs PPI Degree前10位基因相同的基因。為進一步驗證，筆者分別收集了4例OA患者和非OA患者滑膜組織進行qRT-PCR驗證，發現MMP-9在OA患者滑膜中呈高表達，且差異有統計學意義（P < 0.01）；LPL在OA患者滑膜中呈低表達，且差異有統計學意義（P < 0.05），因此認為，MMP-9與LPL很有可能成為OA診斷的生物標志物。

本研究發現，DEGs主要參與對皮質類固醇的反應過程。皮質類固醇是腎上腺皮質產生的類固醇，類固醇引起的骨病與骨細胞數量減少有關［15-16］，WEINSTEIN等［17］的小鼠模型研究也證明骨細胞凋亡與皮質類固醇的使用相關。骨細胞是負責骨骼生產和重塑的間質衍生細胞，通過產生細胞外基質蛋白調節骨骼結構和骨基質礦化，并通過產生細胞因子或直接細胞接觸誘導骨細胞生成。而OA的特征之一就是骨細胞的凋亡［18］。因此，DEGs可能通過影響骨細胞凋亡從而誘發OA。

在KEGG通路富集分析中，DEGs富集主要在IL-17信號通路、PPAR信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和糖酵解參與反應。IL-17家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F，它們可以調節宿主防御和慢性炎癥，導致組織損傷和自身免疫效應，并與細胞和組織中表達的特定受體結合，有學者認為，IL-17在OA的病理生理過程中起著重要的作用［19］。IL-17在OA患者的滑膜中過度表達，且IL-17在體外能刺激骨吸收和膠原破壞［20］。IL-17缺陷可以保護宿主免受膠原誘導小鼠關節炎的損害，IL-17基因治療可能導致進一步惡化［21］。因此，OA中的IL-17可引起炎癥和骨破壞，抑制IL-17信號通路可能是治療OA的重要途經。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是屬于類固醇激素受體超級家族的配體激活轉錄因子，包括3個主要成員：PPARα（也稱為NR1C1）、PPARβ/δ（也稱為NR1C2）和PPARγ（也稱為NR1C3）［22］。VASHEGHANI等［23］通過小鼠PPARγ敲除實驗發現，被基因敲除的小鼠骨關節軟骨退化增加，軟骨細胞凋亡。研究表明，PPARγ的激活可以降低OA最相關的分解代謝和炎癥因子的表達和合成。這些因素包括炎性細胞因子（如IL-1β、腫瘤壞死因子-α和IL-6）和MMPs（如MMP-1和MMP-13）。最近研究發現，PPARγ激動劑可以在半月板切除術誘導的關節炎豚鼠模型中減少OA的進展［24-26］。糖酵解是軟骨細胞代謝缺氧環境中的主要供能方式［27］。關節軟骨是一種特殊類型的結締組織，沒有血管，糖酵解供給維持軟骨合成代謝和分解代謝之間的微妙平衡。而這對于軟骨組織的長期完整性和自我修復能力至關重要［28］。在OA病理過程中，促炎和分解代謝因子顯著增加，分解代謝加快，同時細胞糖酵解水平增加。糖酵解會促進驅動因子缺氧誘導因子-1（HIF-1）的產生，YUDOH等［29］發現，HIF-1的表達與軟骨退變過程密切相關，其數量隨著OA嚴重程度的增加而增加。

筆者將DEGs PPI Degree排名前10位的基因和治療OA藥物的靶基因取交集，得到了MMP-9、MMP-1和LPL。對這3個基因進行qRT-PCR驗證，發現MMP-9、LPL與DEGs篩選的結果一致，因此認為，MMP-9與LPL很有可能成為OA診斷的生物標志物。

LPL是絲氨酸酯酶家族的一員，是從乳糜微粒和極低密度脂蛋白中水解甘油三酯的限速酶［30］。DRAGOJEVI?等［31］實驗發現，OA與健康對照組相比，因為脂肪代謝的減低，OA組織顯示較低的LPL、成骨細胞生成以及較高的破骨細胞生成。LPL能介導甘油三酯水解產生游離脂肪酸，在LPL生成較低的脂肪代謝中，小鼠骨髓培養物和大鼠細胞系中的破骨細胞生成增加從而造成骨組織的損害［32］。幾項體外研究也表明，由LPL組成的脂聯素通過抑制破骨細胞形成和活性，促進成骨細胞分化和增殖，對骨產生消極影響［33-35］。LPL在OA中的低表達會促進破骨細胞的生成，抑制成骨細胞分化從而影響軟骨下骨。而關節軟骨組織退化是造成OA的主要病理變化［36］。HEILPERN等［37］將小鼠MMP-9基因敲除后發現，OA動物模型表型顯著減少。MMP-9能促進Ⅳ型膠原蛋白水解活性，通過降解OA患者關節內非膠原基質成分，使關節內結締組織遭到破壞［38］。在導致OA的潛在機制中，重要的是機械應力，包括關節不穩定和損傷，以及易患OA的因素，如衰老。這些因素導致軟骨細胞中生化途徑的激活，從而導致細胞外基質被MMPs和聚集蛋白聚糖酶（ADAMTSs）降解［39］。此外，MMP-9在OA的早期階段主要通過降解細胞外基質發揮作用。

與以往研究不同的是，我們新發現LPL在OA中的重要作用，這些關鍵基因可能會或為OA的生物標志物，以檢測疾病的發生、發展。同時發現IL-17信號通路、PPAR信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和糖酵解的生物通路可能與OA發展有關，其具體機制尚需進一步的研究驗證。但本文尚存在不足之處，例如篩選差異表達基因來源的樣本量較少，且樣本源自于美國OA患者，與國內OA患者存在一定的種族差異，今后需要獲取更多的國內樣本進行驗證。

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收稿日期：2022-09-10；修回日期：2022-10-28