孔雀石綠和隱色孔雀石綠溶液穩定性探討

馬瑞欣

摘 要：探討了孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩定性與溫度、介質的關系。實驗結果表明：乙酸銨對孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩定性起關鍵作用；隱色孔雀石綠溶液較孔雀石綠溶液穩定。隱色孔雀石綠在乙腈中不論室溫還是4 ℃均可穩定存在；孔雀石綠在乙腈中不穩定，4 ℃在其溶液中可檢測到隱色孔雀石綠，且濃度越低，轉化成隱色孔雀石綠的速度越快。

關鍵詞：孔雀石綠；隱色孔雀石綠；穩定性

孔雀石綠是水產養殖中的禁用藥物，雖已禁用多年，但仍有檢出?？兹甘G在水生動物體內迅速代謝為隱色孔雀石綠，二者都具有潛在的致癌性、致突變性和致畸性［1］。隱色孔雀石綠消除緩慢，適宜作為監測孔雀石綠的標志物［2］?？兹甘G和隱色孔雀石綠的結構如圖1所示，孔雀石綠易溶于水，隱色孔雀石綠不溶于水，但二者均易發生去甲基化等反應導致降解［3-5］。筆者在多年使用液相色譜熒光檢測法［6］和液相色譜-串聯質譜法［7］檢測孔雀石綠的過程中發現孔雀石綠和隱色孔雀石綠的穩定性與保存介質、溫度等有關。本文對此進行了歸納和總結，以期對水產品檢測工作者在使用標準溶液和查找檢測中出現的問題時提供幫助。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與材料

LC-20AD液相色譜儀（日本島津）—QTRAP 4500 三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX）；高效液相色譜儀（Agilent1100，配有熒光檢測器）、十萬分之一電子天平（SECURA225D-1CN，賽多利斯）。

孔雀石綠草酸鹽標準品、隱色孔雀石綠標準品、隱色孔雀石綠-D6標準品（均為Dr.Ehrenstorfer）、孔雀石綠-D5苦味酸鹽標準品（WiTEGA）；乙腈（色譜純，Merck）、乙酸銨（色譜純，Honeywell）、甲酸（色譜純，DIKMA）。

實驗所用水為超純水。

1.2 試樣制備

1.2.1 標準溶液的配制

用十萬分之一電子天平分別稱取適量標準物質，其中的孔雀石綠草酸鹽和孔雀石綠-D5苦味酸鹽需進行折算，用乙腈溶解并定容，配制成100 μg/mL的儲備液。臨用時稀釋成所用濃度的標準溶液。

1.2.2 樣品上機溶液制備

在草魚空白樣品中加入隱色孔雀石綠標準溶液，加標量3.0 μg/kg。按照GB/T 20361-2006［6］進行提取，制備上機溶液。

1.3 上機條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX? Eclipse XDB-C 18柱（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）； 流動相：乙腈+乙酸銨（pH=4.5，0.125 mol/L）=80+20；流速1.0 mL/min ；激發波長：265 nm，發射波長：360 nm； 柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL 。

1.3.2 液相色譜-串聯質譜條件

液相色譜條件：色譜柱 Accucore TM aQ（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）； 進樣量2 uL；柱溫：40℃；樣品溫度：10 ℃ ；流動相：A.5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%甲酸），B.甲醇；梯度洗脫：0～1 min 2% B，1～2 min 98% B～80% B，2～4 min 98% B，4～4.1min 98 % B～20% B，4.1～6 min 2% B。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），多反應掃描（MRM）正離子模式，噴霧電壓5 500 V，氣簾氣30 PSi， 碰撞氣Medium，溫度550 ℃，霧化氣55 Psi，輔助加熱氣55 PSi。質譜條件及參數見表1。

2 結果與討論

2.1 隱色孔雀石綠的穩定性與介質和溫度的關系

由1.2.2得到上機溶液，溶劑為乙腈+乙酸銨（0.1 mol/L ，pH=10.0）=1+1； 20 ng/mL隱色孔雀石綠標準溶液，溶劑為乙腈。上機溶液和標準溶液分別分成兩份，一份室溫避光存放，一份4 ℃避光存放；用液相色譜熒光檢測器分別測定峰面積，結果如圖2所示。

由圖2可知，隱色孔雀石綠即使濃度較低，2個月內其穩定性不受溫度和保存介質的影響；2個月后，室溫下保存的樣品溶液濃度開始緩慢下降，但室溫下的標準溶液和4 ℃下保存的樣品溶液和標準溶液可以穩定至少6個月。

2.2 孔雀石綠、隱色孔雀石綠標準溶液4 ℃的穩定性與介質的關系

分別用乙腈、乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）、水分別稀釋孔雀石綠、隱色孔雀石綠標準溶液至100 ng/mL單標，4 ℃保存。上機測試前用乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）分別稀釋成10 ng/mL的溶液，按照1.3.2條件測定其濃度。另外配置10 ng/mL的標準溶液單點法進行定量，結果見圖3。

由圖3a可知，4 ℃時100 ng/mL孔雀石綠只有在乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）溶液中才可穩定存在2個月；由圖3b可知，4 ℃時100 ng/mL隱色孔雀石綠在乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）溶液和乙腈中均可穩定存在2個月；孔雀石綠在水溶液中的濃度均呈現測不準狀態，可能與其存在形式發生變化有關［1，8，9］；隱色孔雀石綠的測不準可能與其不溶于水有關。在100 ng/mL孔雀石綠乙腈溶液中檢測到了隱色孔雀石綠的定性定量離子，見圖3C，說明孔雀石綠可能部分轉化成了隱色孔雀石綠。為了進一步探究其轉化速率與濃度的關系，用乙腈稀釋孔雀石綠儲備液為1 μg/mL和 100 ng/mL孔雀石綠標準溶液，4 ℃避光保存，上機測試前用乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）分別稀釋成10 ng/mL的溶液，按照1.3.2條件測定轉化成隱色孔雀石綠的情況，測定結果如圖4 所示。由圖4可知，4 ℃乙腈作為溶劑保存時，孔雀石綠濃度越小，轉化速率越快。

3 結論

通過上述實驗測定孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩定性可知：（1）乙酸銨對孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩定性起關鍵性作用。（2）隱色孔雀石綠溶液較孔雀石綠溶液穩定。隱色孔雀石綠在乙腈中不論室溫還是4 ℃均可穩定存在；孔雀石綠在乙腈中不穩定，4 ℃在其溶液中可檢測到隱色孔雀石綠，且濃度越低，轉化成隱色孔雀石綠的速度越快。（3）用乙腈配制的孔雀石綠和隱色孔雀石綠標準儲備液應嚴格按照檢測標準［6-7］的要求-18 ℃避光保存。

參考文獻：

[1]PLAKAS S M，El SAID K R， STEHLY G R，et al.Uptake，tissue distribution，and metabolism of malachite green in the channel catfish （Ictalurus punctatus）[J].Can.J.Fish.Aquat.Sci.，1996，53（6）：1427-1433.

[2] MITTELSTAEDT R A，MEI N ，WEBB P J，et al.Genotoxicity of malachite green and leucomalachite green in female Big Blue B6C3F1 mice[J].Mutation Research，2004，561（1-20）：127-138.

[3] CHA C J， DOERGE D R，CERNIGLIA C E.Biotransformation of Malachite Green by the fungus Cunninghamella elegans[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（9）：4358-4360.

[4] BERGWERFF A，SCHERPENISSE P.Determination of residues of malachite green in aquatic animals[J].Journal of Chromatography B，2003，788：351-359.

[5] MITROWSKA K，POSYNIAK A，MUDAKI J.Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A，2005 ，1089（1-2）：187-192.

[6] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法：GB/T 20361-2006[S].北京：中國標準出版社：2006：1-4.

[7] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定：GB/T 19857-2005[S].北京：中國標準出版社：2005：1-7.

[8] SRIVASTAVA S，SINHA R，Roy D.Toxicological effects of malachite green[J].Aquatic Toxicology，2004，66（5）：319-329.

[9] ALDERMAN D J，CLIFTON-HADLEY R S.Malachite green： a pharmacokinetic study in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss（Walbaum）[J].Journal of Fish Diseases，1993，16（4）：296-311.

（收稿日期：2022-09-22）