噬菌體制劑和杜仲提取物聯用減少凡納濱對蝦工廠化養殖前期換水量的可行性探究

魏玉婷 凌濤 徐濤 孫曉林 呂永 鄭潤玲

摘 要：為探究減少凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）工廠化養殖日換水量的可行性，在凡納濱對蝦工廠化換水養殖的前期（0～34 d），聯用噬菌體制劑和杜仲葉提取物。結果表明：該養殖模式下，凡納濱對蝦養殖前期水體中的弧菌數量可得到有效抑制，換水量可減少33.33%，養殖全程結束時，對蝦的增重率可提高40.40%。

關鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；工廠化；節水；噬菌體；杜仲葉提取物

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）因肉質鮮美，一直深受中國消費者的喜愛。“十三五”期間全國凡納濱對蝦養殖量從167.22萬噸增長至186.29萬噸［1-2］。山東省2021年的凡納濱對蝦產量為21.67萬噸［3］，占全國總產量的10.96%，是我國凡納濱對蝦的主要產地之一。對蝦工廠化養殖是一種集約化高密度的養殖模式，因具有土地利用率高，節約水資源，養殖環境相對可控，可顯著提升對蝦養殖產量等特點［4］，被公認為一種可以大力推廣的養殖模式。山東省農業農村廳正在開展漁業工廠化養殖的大力推廣，目標到2030年將工廠化養殖的規模發展壯大到3 000萬立方米水體［5］。濰坊市是山東省較早進行凡納濱對蝦工廠化養殖的地市，目前主要以工廠化換水養殖為主，近些年隨著養殖規模不斷擴大，養殖密度不斷提高，對對蝦養殖環境的調控壓力也不斷增大。當養殖水體發生惡化時，極易爆發弧菌病，嚴重威脅對蝦的健康養殖。除了使用化學消毒產品以外，很多養殖廠不得不增大換水量或換水頻次，以保證養殖的順利進行，這不僅造成水資源浪費，也加大了尾水處理的難度，增加了環境污染的風險。

噬菌體是一種感染細菌和古細菌的病毒，可通過對細菌的裂解作用殺死致病菌，降低其感染概率，達到預防與治療細菌性疾病的效果，具有專一性強、不易產生抗性、代謝快、易開發及成本低等優點［6］。目前，已經開展了噬菌體在節肢動物、軟體動物、棘皮動物以及一些海水魚類中的研究，結果證明噬菌體或噬菌體雞尾酒可以有效預防或治療常見的弧菌病［7］。

本文通過弧菌噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯合使用控制凡納濱對蝦養殖水體中的弧菌數量，提高凡納濱對蝦的抗逆性，進而減少對蝦養殖過程中的換水量，為凡納濱對蝦工廠化換水養殖向著更加節水環保型發展提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點和材料

本試驗在濰坊市濱海區恒海生物有限公司的2號和3號兩個養殖車間內進行，兩個養殖車間的結構和空間布局完全一致，車間內均設有長方型水泥養殖池32個，底面積為31 m2。試驗過程中24 h充分曝氣，70天以內鹽度為10‰左右，70天后鹽度逐漸調到18‰左右。

6月18日購入南通海大凡納濱對蝦“快大”品系P5苗，進行25 d標粗，于7月13—16日進行分苗，蝦苗規格2 200尾/kg，按700尾/㎡的放養密度轉移到養殖車間養殖，7月17日養殖試驗正式開始。試驗所用弧菌噬菌體制劑和杜仲葉提取物由山東信得生物科技有限公司提供，試驗飼料為市售對蝦商品料。

1.2 試驗管理和分組

3號車間為對照組，從養殖試驗開始到第80天池水深60 cm，每日換水50%，從第81天到試驗結束池水深80 cm，換水量為62.5%。每周使用過硫酸氫鉀消毒一次，并重新潑灑有益菌。

2號車間為試驗組，7月17日—8月20日進行為期34 d的節水試驗，節水試驗期間減少每日換水量，池水深50 cm，日換水率為40%。自7月23日起每周一次潑灑噬菌體制劑，用量為4 mL/m3，連用2 d；同時每周一次使用噬菌體制劑進行拌料投喂，用量為每千克飼料添加噬菌體制劑20 mL，每日2餐，連喂3 d。8月6—20日，每日用杜仲葉提取物替代噬菌體制劑進行拌料，用量為每千克飼料添加4 g，每日添加兩次。8月21日節水試驗結束，停止向水體和飼料中添加噬菌體制劑和杜葉提取物。8月26日打標和樣品采集后使用過硫酸氫鉀消毒，向池中加水至水深80 cm、日換水量為62.5%，并潑灑有益菌占位。

2個養殖車間的其他養殖管理完全相同。使用相同的葡萄糖氧化酶、乳酸菌、多維等拌料，相同的光合細菌、芽孢桿菌、乳酸菌進行調水。每日投喂5次，投喂量為體重的4%～6%，每日上午9點左右排水，通過池底的虹吸排污口清除池底的殘餌和糞便等污染物。

1.3 樣品采集

在開始養殖前（7月16日）對整個車間進行環境消毒，檢測養殖用水、養殖蝦體弧菌含量。分別在7月27日、8月5日，隨機選取2號養殖車間的6個養殖池進行水樣采集，同時撈取每個池中的凡納濱對蝦進行蝦體采樣，檢測水樣和蝦體的弧菌含量。節水試驗結束后，于8月26日再次對養殖用水取樣進行弧菌含量檢測，作為水質檢測的負對照。各養殖池水樣從現場采集后，分別用無菌海水稀釋至適宜濃度梯度，再從各梯度分別取100 μL進行平板涂布計數；蝦體取樣時，7月16日時取全蝦，7月27日和8月5日均解剖取肝胰腺和腸道的混合物，加等體積的無菌生理鹽水勻漿，取100 μL勻漿液加900 μL生理鹽水進行稀釋，再取100 μL進行平板涂布計數。

養殖試驗過程中分別于8月12日、26日進行打標，觀察對蝦生長速度和生長狀況。10月5日養殖試驗全部結束時，從每個養殖車間隨機選6個養殖池，每個池撈取20尾蝦，分別測量體重、體長、肝胰腺重，計算增重率、肝體比和肥滿度。

1.4 分析方法

1.4.1 弧菌含量檢測 采用TCBS培養法。涂布后，28 ℃恒溫培養48 h，選取有效菌落（平均菌落數在30～300以內），計數菌落形成單位數目（CFU）。

1.4.2 統計分析

增重率（%）= 100 × （平均末體重 - 平均初體重）/平均初體重；

肥滿度（CF）= 100 × 蝦體重 / 體長3；

肝體比（%）= 100 × （肝胰腺重 / 蝦體重）。

試驗統計分析采用計算軟件SPSS 15.0。所有數據在進行統計分析之前，先進行正態性和方差齊性檢驗。評估的變量進行配對樣本均數的T檢驗，以確定兩種養殖模式是否對各評價指標產生顯著影響（P＜0.05）。

2 試驗結果

2.1 噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯用對凡納濱對蝦養殖日換水量的影響

在整個節水試驗期間，對照組（3號車間）的日換水量為297.6 m3，試驗組（2號車間）日換水量為198.4 m3，試驗組比對照組減少了33.33%的日換水量。

2.2 噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯用對養殖用水體中弧菌含量的影響

在節水試驗期間，試驗組的凡納濱對蝦蝦體的弧菌含量得到了有效改善，分苗前蝦體的弧菌含量為3.40×104 cfu/mL，到養殖的第11天（7月27日）時下降到3.50×102 cfu/mL，隨著后期對蝦體重的增長，養殖密度增大，到8月5日時凡納濱對蝦蝦體的弧菌含量有所升高，含量為5.30×103 cfu/mL，仍然遠低于分苗時蝦體的弧菌含量。見表1。

養殖池水的弧菌含量在養殖初期下降到3.52×102 cfu/mL，到8月5日增長至2.15×103 cfu/mL，與分苗前時養殖水體中弧菌含量基本相當。然而，在停用噬菌體制劑和杜仲葉提取物后一個星期（8月26日），養殖池水中的平均弧菌含量升高到1.28×104 cfu/mL，是8月5日時的5.95倍，是7月27日時的36.36倍。見表1。

2.3 噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯用對凡納濱對蝦生長情況的影響

在節水試驗期間對兩組對蝦進行打標稱重，8月12日時試驗組凡納濱對蝦的體重平均為5 g，對照組為2.5 g；到8月26日節水試驗結束時，試驗組對蝦的平均體重為10 g，對照組的對蝦體重為5.15 g。試驗組的增重速度明顯高于對照組（見圖1），且對蝦活力都很強，體色正常，蝦體無明顯破損，蛻殼時間較一致，基本未發現蛻殼不遂的蝦或軟皮蝦。

養殖試驗結束時，采用配對樣本t檢驗以判斷噬菌體制劑和杜促葉提取物聯用對凡納濱對蝦生長情況的影響。結果顯示噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯用對凡納濱對蝦的末體重、體長和增重率在0.01顯著性水平下呈現差異（P＜0.01），肝體比在0.05顯著性水平下呈現差異（P＜ 0.05），肥滿度和出肉率未產生顯著性差異（P＞0.05）。進一步比較其均值發現，試驗組凡納濱對蝦的末體重、體長和增重率均高于對照組（P＜0.01），肝體比低于對照組（P＜0.05），與對照組相比試驗組的增重率提高了40.40%（見表2）。

3 討論

弧菌病是對蝦養殖業中一種常見的細菌性疾病，給對蝦養殖業造成了很大損失，被認為是對蝦養殖業的一個持續性威脅。凡納濱對蝦養殖過程中常見的弧菌主要為哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和霍亂弧菌［8］。在水產養殖過程中利用噬菌體進行弧菌疾病的治療，已經在對蝦［9］、牡蠣［10］等水生動物中得到了驗證。Chen等［11］發現利用患病蝦的腸道和養殖廢水中的5種致病弧菌分離得到的5種新噬菌體，制成噬菌體組合物可以有效抑制致病菌的生長。有報道指出，養殖水體中引起對蝦感染發病的弧菌密度閾值為104 cfu/mL［12］，本研究中采用噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯用的方式控制養殖水體的質量，在日換水量減少了33.33%的情況下，并沒有導致養殖水體中弧菌含量的升高，且完全控制在引起對蝦感染發病的弧菌密度閾值范圍之內。然而，當停用了噬菌體制劑和杜仲葉提取物7 d后，各水池的平均弧菌含量上升到1.28×104 cfu/mL，對蝦感染弧菌的風險大大增加。在節水試驗期間，凡納濱對蝦蝦體的弧菌含量得到明顯的控制，各養殖池也無明顯發病現象，說明噬菌體和杜仲葉提取物聯用可以在減少養殖換水量的情況下，保證凡納濱對蝦的健康生長。

杜仲葉提取物中的主要成分為綠原酸、丁香脂素雙糖苷、地普黃酮，具有殺菌抑菌和抗氧化作用，能消除動物體內過多的自由基，從而提高機體的非特異性免疫［13］。在凡納濱對蝦飼料中添加杜仲可以顯著提高凡納濱對蝦肌肉和內臟團的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性，并且相應降低丙二醛值［14］。此外，在凡納濱對蝦的養殖過程中使用杜仲葉提取物還可以提高對蝦肝胰腺組織中的B細胞數量，提高對蝦肝胰腺的消化吸收能力［13］。本研究中，在凡納濱對蝦養殖前期減少日換水量的同時，8月6—20日連續向對蝦日糧中加入杜仲葉提取物，8月12日和26日兩次打標結果顯示，試驗組的蝦體重為對照組的2倍，幼蝦階段的生長效果明顯提高。到養殖試驗結束時，試驗組對蝦的增重率比對照組提高43.04%，推測可能是杜仲葉提取物對幼蝦肝胰腺和腸道的健康發育起到了重要的作用。

4 結論

在凡納濱對蝦工廠化換水養殖的前期（0～34 d），通過噬菌體制劑和杜仲提取物聯用可以有效控制水體中弧菌含量，保證凡納濱對蝦的健康生長，日換水量可減少33.33%，全程養殖結束時，凡納濱對蝦的增重率提高了40.40%。

參考文獻：

[1]農業農村部漁業漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會.中國漁業統計年鑒[M].北京：中國農業出版社，2017：26，34.

[2] 農業農村部漁業漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會.中國漁業統計年鑒[M].北京：中國農業出版社，2021：22，24.

[3] 農業農村部漁業漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會.中國漁業統計年鑒[M].北京：中國農業出版社，2022：26，34.

[4] 陳釗.凡納濱對蝦工廠化養殖系統氮收支與水環境調控[D].青島：中國海洋大學，2018.

[5] 山東省農業農村廳，山東省養殖水域灘涂規劃（2021-2030年）[A/OL].（2021-8-11）[2022-11-25]. http：//www.shandong.gov.cn/art/2021/8/11/art_100152_10294048.html

[6] 陳愿，張永安，周洋.噬菌體在水產養殖業中的研究進展[J].水產學報，2021，45（9）：1605-1615.

[7] 崔惠敬，耿慧君，王麗麗，等.噬菌體治療海水養殖動物常見細菌性疾病的研究進展[J].國外醫藥抗生素分冊，2019，40（5）：445-450.

[8] 李君怡，吳秋平，周疆，等.凡納濱對蝦弧菌病及其防治方法研究進展[J].水產科技情報，2022，49（2）：106-111.

[9] STALIN N，SRINIVASAN P.Efficacy of potential phage cock-tails against Vibrio harveyi and closely related Vibrio species isolated from shrimp aquaculture environment in the south east coast of India[J].Veterinary Microbilogy，2017，207：83-96.

[10] 于云娟.副溶血弧菌噬菌體qdvp001的分離鑒定及其在牡蠣凈化中的初步應用[D]. 青島：中國海洋大學，2012.

[11] CHEN L.，FAN J Q，YAN T W，et al.Isolation and chracterization of specific phages to prepare a cocktail preventing Vibrio sp.Va-F3 infections in shrimp （Litopenaeus vannamei） [J].Frontiers in Microbiology，2019，10：2337.

[12] 于占國，林風翱，賀杰.異養細菌與蝦病關系的研究[J].海洋學報，1995，17（3）：85-91.

[13] 李軍濤，李金寶，冼健安，等.杜仲葉提取物對凡納濱對蝦生長、免疫酶活性及肝胰腺組織的影響[J].南方農業學報，2018，49（9）：1858-1864.

[14] 郭永軍，邢克智，陳成勛，等.八種單方中草藥添加劑對凡納濱對蝦健康指標的影響[J].中國水產，2009（1）：54.

（收稿日期：2022-11-25；修回日期：2023-03-14）