金黃色葡萄球菌感染下骨細胞對破骨細胞分化形成的影響研究

儀洋洋,劉飛飛,阮玉山,李紹波,張磊,李穎,任莉榮

(大理大學第一附屬醫院脊柱外科,云南 大理 671000)

骨髓炎是骨組織以金黃色葡萄球菌為主要病原菌的一種感染性疾病,以嚴重的炎性反應及進行性的骨破壞為特征[1],常導致感染性骨缺損、骨不連,是骨科的一大治療難題。目前,關于炎性骨破壞的具體發生機制尚不清楚。骨細胞作為骨組織內數目最多的細胞,其由成骨細胞進一步分化而來。研究發現,骨細胞可合成分泌許多細胞因子及信號分子,來調節成骨細胞及破骨細胞的活性,在骨重建及骨組織內環境穩態的維持方面發揮著極其重要的作用[2]。但骨細胞在炎性骨破壞發生機制中的作用如何,相關研究甚少。本研究通過金黃色葡萄球菌感染骨細胞獲取骨細胞來源的條件培養基(conditioned medium,CM),并使用該條件培養基對破骨細胞前體細胞(RAW264.7細胞)進行誘導培養,觀察破骨細胞分化形成的情況,并檢測破骨細胞分化形成標志性基因的表達情況,探討金黃色葡萄球菌感染下骨細胞對破骨細胞分化形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 MLO-Y4細胞、RAW264.7細胞系(均購于昆明動物所),金黃色葡萄球菌(ATCC 4330),磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)及H-DMEM培養基(HyClone公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),溶菌酶(Solarbio公司),核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)(R&D Systems公司),抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒(Sigma公司),RNA抽提試劑盒(Thermo Fisher公司),A PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus) 購于寶生物工程(大連)有限公司,酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司),CFX96 Real-time System(BIO-RAD公司)。

1.2 金黃色葡萄球菌感染骨細胞后骨細胞源性CM的獲得 將MLO-Y4細胞接種到Ⅰ型膠原涂層板上培養35 d獲得骨細胞,期間2～3 d換液1次。隨后金黃色葡萄球菌活菌以40∶1的感染復數感染骨細胞4 h,4 h后用溶菌酶滅活細胞外金黃色葡萄球菌,更換新鮮培養基后,細胞繼續培養72 h,隨后收集培養基獲得骨細胞源性CM。

1.3 CM對RAW264.7細胞的誘導培養 陽性對照組(RANKL組)使用100 ng/mL的RANKL進行誘導培養,實驗組(30%CM組)使用體積分數為30%的CM進行誘導培養,空白對照組(PBS組)使用等體積的PBS誘導培養。按實驗分組將RAW264.7細胞分別接種于96孔板及6孔板,待細胞鋪滿孔底約60%更換新鮮培養基。對應孔分別加入誘導培養液,每2～3 d換液1次,換液后重新加入誘導液。共誘導培養5 d,5 d后96孔板使用TRAP染色試劑盒染色,6孔板收集細胞后進一步提取RNA行RT-qPCR檢測。

1.4 TRAP染色 按TRAP染色試劑盒說明書的操作步驟配制染液并進行染色。簡單步驟為：去離子水清洗2遍,固定液固定細胞30 s,之后去離子水清洗3遍,加入TRAP染液,避光條件下染色1 h。隨后去離子水再次清洗3遍,加入蘇木素染色1 min,堿性自來水漂洗4遍后,在倒置相差顯微鏡下觀察,將圖像放大100倍,計數每個視野下破骨細胞的數目(破骨細胞的界定：TRAP染色陽性,且細胞核≥3個)。

1.5 RT-qPCR檢測破骨細胞標志性基因的表達 根據實驗分組,對應時間點收集6孔板內的RAW264.7細胞,按GeneJET RNA抽提試劑盒的操作手冊提取RNA,反轉錄合成cDNA(按Takara公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的操作步驟合成cDNA),并按Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM的操作步驟進行RT-qPCR反應。檢測對應時間點破骨細胞特異性基因的表達情況：TRAP、calcitonin receptor(Cal R)、cathepsin K(Cathe K)及MMP-9,目的基因的表達量均通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)進行標準化,通過2-ΔΔCt的方法計算各目的基因的相對表達量。實驗使用的引物序列,TRAP：正向(5′-3′)GCGACCATTGTTAGCCACATACG,反向(5′-3′)CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT;calcitonin receptor(Cal R)：正向(5′-3′)TGGTGCGGCGGGATCCTATAAGT,反向(5′-3′)AGCGTAGGCGTTGCTCGTCG;cathepsin K(Cathe K)：正向(5′-3′)AGCAGAACGGAGGCATTGACTC,反向(5′-3′)TTTAGCTGCCTTTGCCGTGGC;MMP-9：正向(5′-3′)GCTGACTACGATAAGGACGGCA,反向(5′-3′)GCGGCCCTCAAAGATGAACGG;GAPDH：正向(5′-3′)CCCAGAAGACTGTGGATGG,反向(5′-3′)CAGATTGGGGGTAGGAACAC。

2 結 果

2.1 TRAP染色結果 RAW264.7細胞誘導培養5 d后,PBS組基本無破骨細胞分化形成,30%CM組及RANKL組均見明顯的破骨細胞形成(見圖1),圖像放大100倍,每個視野下破骨細胞的數目分別為：PBS組(0.231±0.203)個,30%CM組(19.154±2.115)個,RANKL組(52.000±3.317)個。各組間比較差異均具有統計學意義(P<0.05),30%CM組誘導形成的破骨細胞數目明顯多于PBS組,但少于RANKL組。

a 各組破骨細胞分化形成的情況(TRAP染色) b 各組破骨細胞分化形成數目分析

2.2 RT-qPCR結果 RAW264.7細胞誘導培養5 d后,30%CM組及RANKL組均導致破骨細胞分化形成的標志性基因：TRAP、calcitonin receptor(Cal R)、cathepsin K(Cathe K)、MMP-9的表達增高,均高于PBS組(見圖2)。各組間比較,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

a TRAP的表達情況 b calcitonin receptor(Cal R)的表達情況 c cathepsin K(Cathe K)的表達情況 d MMP-9的表達情況

3 討 論

正常骨骼為一無菌的組織,其持續不斷地進行著骨重建,而成骨細胞、破骨細胞及骨細胞則緊密地調節著骨的重建過程。成骨細胞起源于間充質干細胞,并進一步分化成骨細胞,調節骨的形成;而破骨細胞起源于造血細胞的單核巨噬細胞系,調節骨的吸收。目前關于感染性骨缺損、骨不連發生機制的研究發現,在骨形成方面,細菌生物膜及炎性細胞因子抑制了骨髓間充質干細胞的成骨分化能力[3],而金黃色葡萄球菌則抑制了成骨細胞的增殖并誘導其凋亡[4],金黃色葡萄球菌還能通過金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)、殺白細胞素及凝固酶等抑制成骨細胞對Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白等的合成[4]。此外,在體內及體外的實驗研究中均發現,金黃色葡萄球菌還可侵入成骨細胞,進而引起成骨細胞的死亡,而侵入成骨細胞的金黃色葡萄球菌還可在其內存活并增殖,并被認為與慢性骨髓炎及復發性骨髓炎的發生有一定關系[5-6]。在骨吸收方面,金黃色葡萄球菌[7]及其菌壁蛋白(SPA[8]、脂磷壁酸[9-10]、肽聚糖[11-12])均具有促進破骨細胞分化形成、增強骨吸收活性的作用,金黃色葡萄球菌同樣可侵入破骨細胞,并在破骨細胞內自我復制[13]。由此可見,金黃色葡萄球菌感染導致的炎性骨破壞、骨缺損,是其抑制骨形成并促進骨破壞增加的共同結果。

骨細胞是由成骨細胞分化而來,占骨骼內細胞總數的90%～95%,散落于骨基質中。骨細胞被一個直徑為15～20 μm的腔隙包圍,骨細胞的樹突通過狹窄的小管穿過骨基質。骨細胞的腔隙和小管被稱為腔隙-小管系統(lacunar-canalicular system,LCS),液體可通過該系統為骨細胞提供養分,維持骨細胞的活性及功能,并通過該系統實現細胞間的信號傳導。骨細胞作為一種多功能的信號感知細胞,可調節成骨細胞及破骨細胞的活性,在骨組織內環境穩態的維持方面發揮著極其重要的作用[2]。研究發現,在金黃色葡萄球菌感染下,金黃色葡萄球菌同樣可以侵入骨細胞,并在細胞內長期存活,且并不引起骨細胞死亡增加[14]。課題組使用感染復數為40∶1對骨細胞感染4 h后撤出,細胞再繼續培養的過程中,細胞并未發生凋亡壞死增多的情況,這一結果與上述結果一致。但金黃色葡萄球菌感染下,骨細胞對成骨細胞及破骨細胞的影響如何,其是否調控骨形成及骨破壞,參與炎性骨破壞的病理過程未見相關報道。本研究在金黃色葡萄球菌感染骨細胞后,骨細胞來源的條件培養基作用于破骨細胞前體細胞RAW264.7細胞后發現,其誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化,導致破骨細胞分化形成的數目增多,并導致破骨細胞標志性基因的表達增高。提示在金黃色葡萄球菌的感染下骨細胞可合成分泌一些活性分子促進破骨細胞的分化形成,導致骨破壞增加,進而參與炎性骨破壞的進程。但具體的活性成分及其分子機制,有待進一步研究。并且,骨細胞源性活性分子的產生,是金黃色葡萄球菌菌壁蛋白、毒力因子或是金黃色葡萄球菌侵入骨細胞引起,具體機制如何,仍需進一步研究。

破骨細胞由單核巨噬細胞系分化而來,是目前已知的唯一具有骨吸收活性的細胞,在破骨細胞的分化形成過程中,巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)及RANKL起到極其重要的作用,代表了破骨細胞分化形成的經典信號通路。而其他一些細胞因子,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-11、LIGHT等,則可替代M-CSF或RANKL來促進破骨細胞的分化形成,進而代表了破骨細胞分化形成的非經典信號通路[15]。本研究在金黃色葡萄球菌感染骨細胞后,骨細胞源性條件培養能誘導破骨細胞分化形成增多,但其培養基內起作用的具體成分不得而知,是通過RANKL的合成增多,再通過經典信號通路促進破骨細胞的分化形成;還是通過炎性細胞因子合成增多,如TNF-α、IL-1、IL-6等,再通過非經典信號通路促進破骨細胞分化形成;或是通過細胞外囊泡,攜帶細胞因子、RNA等來促進破骨細胞分化形成;亦或是上述機制的共同作用,導致破骨細胞分化形成的增多,均有待進一步研究。

綜上所述,本研究從骨細胞的角度出發,探討了金黃色葡萄球菌感染下骨細胞對破骨細胞分化形成的影響。研究發現,金黃色葡萄球菌感染下骨細胞可合成分泌一些活性分子,誘導破骨細胞分化形成增多。由此提示,在炎性骨破壞的發生過程中,除了金黃色葡萄球菌及其菌壁成分直接導致破骨細胞分化形成增多外,骨細胞及成骨細胞[16]均可通過信號分子促進破骨細胞的分化形成增多。因此,骨細胞作為骨組織內數目最多、存活時間最長的細胞,深入探討炎性環境下骨細胞對成骨細胞及破骨細胞的調節作用,便于揭示炎性骨破壞的發生機制,有望為骨髓炎的治療提供新的思路及靶點。