分光光度法測定三角梅花中黃酮含量

摘 要 以蘆丁為對照，采用分光光度法對福建省漳州市三角梅花中黃酮含量進行測定。結果表明，蘆丁標準溶液在510 nm處吸收值最大，其濃度同吸光值間線性關系良好（R2=0.999 8）；1 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.40%；該法在數據準確性上有較好表現（RSD=1.10%）。分光光度法準確度高、重復性好、簡便可行，可用于三角梅花中黃酮含量的測定。

關鍵詞 三角梅花；分光光度法；黃酮；福建省漳州市

中圖分類號：O657.32 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.22.013

三角梅屬紫茉莉科葉子花屬木本植物，其花具有花量大、色澤鮮艷、花期長等特點。2018年，我國三角梅種植規模為2.00萬hm2左右，其中僅福建省漳州市就有0.13萬hm2以上，年產值超過15億元，成為全國最大的三角梅產銷中心之一[1]。黃酮類化合物大多具有顏色，是植物的主要活性成分之一，其基本結構是C6-C3-C6。黃酮類化合物具有很高的藥用價值，可以防治心腦血管疾病、降低血脂和膽固醇、抗氧化和清除自由基、抗菌、抗腫瘤等[2]。三角梅可入藥，有調和氣血，治白帶、調經的功效，光照不足，三角梅易落葉衰枯，作為廢棄物丟棄，不僅浪費資源，還會造成環境污染。因此，充分挖掘三角梅花的應用潛力，加大對三角梅的開發利用，不僅可以增加三角梅的附加值，還可以達到合理利用資源、減少環境污染的目的。徐夙俠等人在花粉和花粉透鏡管內測定了黃酮醇的積累，并采用毛細管電泳分析了3種白花三角梅品種中的類黃酮[3-4]。黃瑩等人采用紫外分光光度法測定了野壩子中的總黃酮，結果表明該方法準確、可靠，可用于野壩子中總黃酮的含量測定[5]。梁愛軍提出以5%NaNO2-10%Al（NO3）3-4%NaOH為顯色體系測定沙棘葉總黃酮的優化方法[6]。羅序燕等人研究表明測定黃酮類化合物的方法主要包括分光光度法、熒光光度法、液相色譜法和毛細管電泳法等[7]。筆者在現有研究基礎上，應用分光光度法測定漳州職業技術學院校園內三角梅花中黃酮含量，為福建省漳州市三角梅產業的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：無水乙醇（EA）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁[Al（NO3）3]和氫氧化鈉（NaOH）均為國產分析純，蘆丁對照品（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號C10819709）；實驗用水：蒸餾水；實驗用三角梅花：取自漳州職業技術學院。

試驗儀器：GZX-9070 MBE數顯鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；FW-400A高速萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）；UV-1801紫外可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司]；FA2204電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；HH-S218數顯電熱恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 三角梅花待測液制備

用蒸餾水將三角梅花洗凈并于105 ℃鼓風干燥箱中烘干4 h后，放入粉碎機粉碎，過40目篩得三角梅花粉末，備用。稱取一定量三角梅花粉末放入150 mL圓底燒瓶內，加入50 mL 75%乙醇溶液或無水乙醇，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置并經定量濾紙過濾，過濾后的三角梅花濾液備用。

1.2.2 蘆丁對照品溶液的制備

準確稱取105 ℃干燥后的蘆丁標準品75.0 mg，用無水乙醇溶解，置于250 mL容量瓶中，定容至刻度線，配成300 μg·mL-1的標準溶液。

1.2.3 最大吸收波長的確定

取蘆丁標準溶液4 mL，采用5%NaNO2-10%Al（NO3）3-1 mol·L-1NaOH顯色，在470～550 nm波長范圍內測定溶液的吸光值。結果顯示，蘆丁標準溶液在510 nm處有最大吸收值，因此，選擇510 nm作為檢測波長。

1.2.4 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定黃酮含量

取2.0 mL待測液置于10 mL比色管中，再依次添加濃度為30%的乙醇至5.0 mL，加入0.5 mL 5%的NaNO2，搖勻靜置6 min，再加入0.5 mL 10%的Al（NO3）3，搖勻靜置6 min，再添加2 mL 1 mol·L-1的NaOH，搖勻，繼續添加30%的乙醇至10 mL，靜置5 min。置于510 nm吸光度下進行比色，測定吸光值。

1.3 方法學考察

分別從線性關系、重復性、加標回收率等方面對1.2.4項下的方法進行方法學考察。

1.3.1 線性試驗

分別精密吸取蘆丁標準溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL比色管中，按照1.2.4中NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定黃酮含量方法，測定吸光值。以蘆丁含量為橫坐標，所測得的吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為

Y=0.001 3X+0.000 3，R2=0.999 8

本試驗的測定結果與李世燕等人在分光光度法測定毛酸漿果中總黃酮含量研究中的R2=0.999 5相比，相關性較高[8]。因此，該分光光度法具有良好的線性關系，可用來測定三角梅花中黃酮含量。

1.3.2 重復性試驗

稱取1 g左右過篩后的三角梅花粉末，按照1.2.1項下方法制備待測液，平行制備3份，其余同1.2.4項下的操作，測定吸光值，計算RSD。

1.3.3 加標回收率試驗

第1組是取6個150 mL圓底燒瓶，其中3個圓底燒瓶為全程空白樣，剩余3個圓底燒瓶為加標回收樣，往3個加標回收樣中分別加入1 mL濃度為300 μg·mL-1的蘆丁標準溶液，再往6個圓底燒瓶中分別加入50 mL 75%乙醇溶液，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置后備用，其余同1.2.4項下的操作，測定6個待測樣的吸光值；第2組是將第1組中往6個圓底燒瓶中分別加入的50 mL 75%乙醇溶液替換成50 mL無水乙醇，僅替換提取液，其余步驟均相同；上述兩組實驗中加標回收樣的黃酮含量與全程空白樣的黃酮含量二者差值的絕對值即為黃酮增量。黃酮增量與所加入的蘆丁標準溶液中的蘆丁含量的比值即為加標回收率。各回收率取平均值，計算RSD。

1.4 數據處理

本研究中單位質量樣品的黃酮含量（%）計算公式如下：

式中，C為單位質量樣品的黃酮含量，%；X為從標準曲線查的蘆丁含量，μg；W為樣品質量，g。

所有數據、表格均采用Excel 2010進行整理。

2 結果與分析

2.1 三角梅花粉末量對黃酮含量的影響

分別稱取1.008 4、1.007 6、1.004 0、2.009 1、2.007 2、2.003 6 g三角梅花粉末于150 mL圓底燒瓶內，加入50 mL 75%乙醇溶液，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置并過濾的待測液按照1.2.4項下的操作測定吸光值，測得三角梅花中黃酮含量分別為2.39%、2.38%、2.43%、2.27%、2.23%、2.22%。結果表明，采用1 g左右的三角梅花粉末測試所得的黃酮平均含量為2.40%，采用2 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.24%。可見，在相同的提取和反應條件下，2 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量小于1 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量。

2.2 提取液乙醇濃度對黃酮含量的影響

分別稱取1.001 2、1.005 6、1.007 8 g的三角梅花粉末于150 mL 圓底燒瓶內，加入50 mL無水乙醇溶液，在70 ℃恒溫水浴1 h，靜置并過濾后的待測液按照1.2.4項下的操作測定吸光值，測得三角梅花中黃酮含量分別為0.773%、0.787%、0.795%。結果表明，采用1 g左右的三角梅花粉末進行測試，用無水乙醇提取的黃酮平均含量為0.785%，遠低于用75%乙醇溶液提取的黃酮平均含量2.40%。可見，三角梅花粉末重量和反應條件不變的情況下，提取液乙醇濃度會影響三角梅花中黃酮的含量，采用無水乙醇提取液所提取出的黃酮含量比用75%乙醇溶液所提取出的黃酮含量少。

2.3 試驗數據的可信度分析

重復性試驗表明，采用1 g左右的三角梅花粉末，測得平均吸光值為1.257，平均含量為2.40%，RSD為1.10%，說明該方法重復性較好，與鄭凱等人所驗證的應用紫外-可見分光光度法測定刺葡萄葉片總黃酮含量擁有較好的重復性和精密性結論一致，也進一步證明采用分光光度法測定植物中黃酮含量的可行性[9]。

2.4 加標回收試驗分析

加標回收試驗結果如表1所示，各加標回收率分別為82.0%、82.7%、87.3%、92.7%、87.3%、92.0%。采用提取液為75%乙醇溶液試驗所得的加標回收率平均值為84.0%，RSD為3.43%，與王麗麗等人研究的分光光度法測定茶葉中總黃酮含量的加標回收率84.35%接近，二者均高于郭麗冰等人的研究結果78.49%，說明此試驗的加標回收情況較好[10-11]。采用提取液為無水乙醇試驗所測得的加標回收率平均值為90.1%，RSD為3.21%，相較而言，提取液乙醇純度高的空白試樣加標回收率更高。

3 結論

采用分光光度法對福建省漳州市三角梅花中黃酮含量進行測定，蘆丁標準溶液在510 nm處有最大吸收值，測試1 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.40%，而測試2 g左右的三角梅花粉末中黃酮平均含量為2.24%；相同重量的三角梅花粉末和反應條件下，提取液乙醇的濃度會影響三角梅花中黃酮含量，采用無水乙醇提取液所提取出的黃酮含量比75%乙醇溶液所提取的少。

試驗過程中所繪制的標準曲線回歸方程內R2為0.999 8，表明標準曲線具有良好的線性關系；在重復性試驗中，RSD為1.10%，可見NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定黃酮含量具有較高精密性；提取液為75%乙醇溶液的加標回收率平均值為84.0%，加標回收率較高。通過此法對漳州市三角梅花中黃酮含量進行測定，有助于進一步拓展三角梅花的應用價值。

參考文獻：

[1] 陳燕賢.三角梅成為漳州城市新名片[J].中國花卉園藝，2018（24）：19.

[2] 方一杰，徐巖成，安毛毛，等.黃酮類化合物的藥動學和藥理作用研究進展 [J].藥學服務與研究，2015（1）：6-9.

[3] 徐夙俠，黃青云，林春松，等.不同育性三角梅品種之間的形態、花粉活力、造訪昆蟲及黃酮醇含量的比較研究[J].植物研究，2018，38（6）：860-868.

[4] 徐夙俠，林春松，黃青云，等.3個三角梅品種中類黃酮的毛細管電泳分析比較研究[J].植物研究，2010，30（6）：718-724.

[5] 黃瑩，徐冠玲，謝夢，等.分光光度法測定野壩子中的總黃酮[J].華西藥學雜志，2015，30（2）：265-267.

[6] 梁愛軍.紫外-可見分光光度法測定沙棘葉總黃酮含量的優化試驗[J].山西林業科技，2018，47（3）：11-14.

[7] 羅序燕，方浩斌，黃瑞宇，等.分光光度法測定甜葉菊廢渣中總黃酮的研究[J].光譜學與光譜分析，2015，35（10）：2820-2824.

[8] 李世燕，閆公昕，朱丹，等.分光光度法測定毛酸漿果中總黃酮含量的研究[J].食品研究與開發，2016，37（13）：129-134.

[9] 鄭凱，劉保山，宋歌，等.比較熒光分光光度法和紫外-可見分光光度法檢測刺葡萄葉片總黃酮含量[J].湖北民族大學學報（自然科學版），2023，41（1）：14-18.

[10] 王麗麗，林清霞，宋振碩，等.分光光度法測定茶葉中總黃酮含量[J].茶葉學報，2021，62（1）：1-6.

[11] 郭麗冰，王蕾.降香總黃酮含量測定方法的研究[J].中藥材，2008，31（5）：694-696.

（責任編輯：張春雨）