荊防顆粒揮發(fā)油β-環(huán)糊精制備工藝的優(yōu)化

曹玲 李因坤 崔琳琳 高艷紅 姜佳峰

荊防顆粒具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛寒的功效[1],處方中的荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、川芎、枳殼、前胡中含有揮發(fā)油成分,經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒等多種藥理作用,是發(fā)揮藥效的主成分[2-3]。但揮發(fā)油具有易揮發(fā)、有效成分穩(wěn)定性差、易氧化變質(zhì)及氣味濃烈等特點(diǎn),不便于貯存和使用,若在制劑過(guò)程中直接加入,易吸附于器具上,不僅降低利用率,成藥性也較差[4-5]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),揮發(fā)油經(jīng)β-環(huán)糊精包合后,使液態(tài)油變成固體粉末的包合物,便于制劑,還可避免揮發(fā)油揮發(fā),提高了穩(wěn)定性。此外經(jīng)β-環(huán)糊精包合后揮發(fā)油在水中溶解度增加,具有緩釋作用,其生物利用度大大提高[6-7]。因此,本研究擬通過(guò)對(duì)比不同揮發(fā)油包合方法,以探尋荊防顆粒揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物最佳制備工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器

GC-2030型高效氣相色譜儀(美國(guó)島津公司);MS1003TS/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];膠體磨(溫州市膠體磨廠)。

1.2試藥

荊芥(批號(hào):200928)、防風(fēng)(批號(hào):202105)、羌活(批號(hào):200701)、獨(dú)活(批號(hào):63120001)、川芎(批號(hào):456221002)、枳殼(批號(hào):200927)、前胡(批號(hào):200927)藥材(中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)高艷紅主任鑒定為正品);β-環(huán)糊精(批號(hào):20210706,孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司);甲醇(批號(hào):20035159)、乙腈(批號(hào):20115187)為色譜純(美國(guó)天地有限公司);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1荊防顆粒揮發(fā)油的提取

荊防顆粒揮發(fā)油A的提取:按照荊防顆粒制法項(xiàng)下,按處方比例稱取川芎、枳殼藥材飲片,投入多功能提取罐中,加入6倍量水,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油,收集揮發(fā)油置冷庫(kù)中貯存?zhèn)溆谩?/p>

荊防顆粒揮發(fā)油B的提取:按照荊防顆粒制法項(xiàng)下,按處方比例稱取羌活、獨(dú)活、荊芥、防風(fēng)、前胡藥材飲片,投入多功能提取罐中,加入6倍量水,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油,收集揮發(fā)油置冷庫(kù)中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2揮發(fā)油空白回收率的測(cè)定與評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算方法

按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則“2204揮發(fā)油測(cè)定法”項(xiàng)下方法[8]測(cè)定混合(A+B)揮發(fā)油的空白回收率,平行操作三次,得到平均空白回收率為92.63%。

×100%

×100%

2.3不同包合方法對(duì)揮發(fā)油包合率和包合物得率影響

以揮發(fā)油包合率和包合物得率為考察指標(biāo),比較膠體磨法、飽和水溶液法、超聲法對(duì)揮發(fā)油包合工藝的影響,優(yōu)選出最佳包合方法。

2.3.1 膠體磨法 量取揮發(fā)油A、B各10 mL,混合均勻,共3份,加入20 mL無(wú)水乙醇,制成混合40 mL揮發(fā)油無(wú)水乙醇溶液。稱取120 g β-環(huán)糊精,加入360 mL水使其成溶解,倒入膠體磨中擠壓攪拌,同時(shí)緩慢滴加混合揮發(fā)油無(wú)水乙醇溶液,包合一定時(shí)間后,放出包合物,冷藏24小時(shí),抽濾,濾渣用石油醚洗滌,40℃干燥,稱重,計(jì)算包合物得率。稱取包合物6 g,置500 mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水300 mL,連接揮發(fā)油提取器,按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則方法“2204揮發(fā)油測(cè)定法”項(xiàng)下方法提取揮發(fā)油,計(jì)算包合率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同包合工藝對(duì)揮發(fā)油包合率和包合物得率的影響

2.3.2 飽和水溶液法 采用磁力加熱攪拌器,分別稱取120 g β-環(huán)糊精,共3份,各加360 mL水,加熱攪拌溶解制成飽和溶液,當(dāng)溫度降至40℃,精密吸取40 mL揮發(fā)油無(wú)水乙醇溶液(配制方法同2.3.1),加至β-環(huán)糊精飽和溶液中,以恒溫40℃,500 r/min攪拌一定時(shí)間,冷藏24小時(shí),抽濾,濾渣用石油醚洗滌,于40℃干燥,稱重,計(jì)算包合物得率。按上述2.3.1項(xiàng)從“稱取包合物6 g”開(kāi)始操作。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.3 超聲法 分別稱取120 g β-環(huán)糊精,共3份,各加360 mL水,加熱攪拌溶解制成飽和溶液,當(dāng)溫度降至40℃時(shí),精密吸取40 mL揮發(fā)油無(wú)水乙醇溶液(配制方法同2.3.1),加至β-環(huán)糊精飽和溶液中,以40℃、30 Hz超聲頻率包合一定時(shí)間,冷藏24小時(shí),抽濾,濾渣用石油醚洗滌,于40℃干燥,稱重,計(jì)算包合物得率。按上述2.3.1項(xiàng)從“稱取包合物6 g”開(kāi)始操作。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知,膠體磨法得到的包合物揮發(fā)油包合率和包合物得率均高于其他2種方法,因此確定采用膠體磨法包合荊防顆粒揮發(fā)油。

2.4包合工藝優(yōu)化

2.4.1 綜合評(píng)分計(jì)算方法 包合率是考察揮發(fā)油包合程度的重要指標(biāo),而包合物得率反映實(shí)際產(chǎn)率。因此以揮發(fā)油包合率和包合物得率的綜合評(píng)分(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),使用SPSS 22.0的熵值法進(jìn)行計(jì)算,Y中包合率(Y1)的權(quán)重系數(shù)為75.93%,包合物得率(Y2)的權(quán)重系數(shù)為24.07%。

2.4.2 單因素實(shí)驗(yàn) (1)考察揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例:固定β-環(huán)糊精∶水為1∶3,包合時(shí)間20分鐘,考察荊防顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的比例對(duì)綜合評(píng)分(Y)的影響,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示荊防顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比在1∶4～1∶12時(shí),隨著投料比的增加,Y先增加,于1∶8時(shí)達(dá)到最高值后略有降低。因此,選擇投料比1∶6～1∶10進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例對(duì)膠體磨法包合揮發(fā)油的影響

(2)考察β-環(huán)糊精與水的比例:固定荊防顆粒揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精為1∶8,包合時(shí)間20分鐘,考察β-環(huán)糊精與水的比例對(duì)Y的影響,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著用水量的增大,Y先增加,于1∶3時(shí)達(dá)到最高值后略有降低,故選擇β-環(huán)糊精與水的比例在1∶2～1∶4進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 β-環(huán)糊精與水比例對(duì)膠體磨法包合揮發(fā)油的影響

(3)考察研磨包合時(shí)間:固定荊防顆粒揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精為1∶8,β-環(huán)糊精∶水為1∶3,考察包合時(shí)間對(duì)Y的影響,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng),Y先迅速增加,當(dāng)包合時(shí)間為20分鐘時(shí)增速減緩,當(dāng)包合時(shí)間為25分鐘時(shí)Y趨于穩(wěn)定,故選擇包合時(shí)間為15～25分鐘進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化。

圖3 研磨包合時(shí)間對(duì)膠體磨法包合揮發(fā)油的影響

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以揮發(fā)油:β-環(huán)糊精(A)、β-環(huán)糊精:水的比例(B)和包合時(shí)間(C)為考察因素,以Y為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2,方差結(jié)果分析見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果如表3所示,建立的回歸整體模型其F值為36.05,P<0.01,說(shuō)明模型極顯著;失擬項(xiàng)P>0.01,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大,模型成立。二次多項(xiàng)回歸方程為Y=87.96+3.58A+2.59B+2.25C-1.00AB+0.42AC+1.16BC-13.93A2-8.42B2-8.04C2,R2=0.9517>0.9,說(shuō)明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好。對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Y來(lái)說(shuō),其中A(揮發(fā)油:β-環(huán)糊精)綜合評(píng)分有極顯著影響(P<0.01),B(β-環(huán)糊精:水)和C(包合時(shí)間)對(duì)綜合評(píng)分有顯著性影響(P<0.05)。A2、B2、C2三個(gè)因素均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。各因素的影響順序?yàn)锳>B>C,三個(gè)因素對(duì)Y的交互影響分別見(jiàn)圖4～6。

圖4 因素?fù)]發(fā)油∶β-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精∶水對(duì)膠體磨法包合揮發(fā)油效果的影響

圖6 因素β-環(huán)糊精∶水、時(shí)間對(duì)膠體磨法包合揮發(fā)油效果的影響

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert v10.0.7軟件求得Y最優(yōu)解為荊防顆粒揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精為1∶8.25,β-環(huán)糊精∶水為1∶3.16,研磨包合時(shí)間為20.76分鐘,在此條件下計(jì)算的綜合評(píng)分為88.56。

為方便車間生產(chǎn)實(shí)際操作,最優(yōu)工藝條件修正為荊防顆粒揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精為1∶8,β-環(huán)糊精∶水為1∶3,研磨包合時(shí)間為21分鐘。按此條件對(duì)包合工藝進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果揮發(fā)油包合率平均為85.98%,包合物得率平均為92.51%,綜合評(píng)分為87.43,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.94%。結(jié)果表明,優(yōu)化的揮發(fā)油包合工藝參數(shù)重復(fù)率好,穩(wěn)定可行。

2.5荊防顆粒揮發(fā)油包合前后氣相色譜法檢測(cè)

荊防顆粒揮發(fā)油包合物用3倍體積石油醚洗滌3次,晾干, 精密稱取適量晾干后的包合物, 置于容量瓶中,加適量無(wú)水乙醇,超聲30分鐘脫包,定容至刻度,濾過(guò),取續(xù)濾液,用乙醇稀釋后進(jìn)樣。色譜柱:DB-624UI,進(jìn)樣口溫度:250℃;分流比:1∶20;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫:100℃保持2分鐘,10℃/分鐘升溫至140℃,保持2分鐘,4℃/分鐘升溫至180℃,保持2分鐘,20℃/分鐘升溫至250℃,保持5分鐘;流速:1 mL/分鐘;FID:300℃,結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示包合前后揮發(fā)油化學(xué)成分保持不變。

注:1 揮發(fā)油;2 包合物。

3 結(jié)論

荊防顆粒處方中含有的羌活、獨(dú)活、荊芥、防風(fēng)、川芎等幾味中藥,揮發(fā)油為其發(fā)揮藥效的主要有效成分。常用的揮發(fā)油包合方法有飽和水溶液法、超聲法、膠體磨法等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)這3種包合方法的比較,發(fā)現(xiàn)飽和水溶液法制備揮發(fā)油包合物,β-環(huán)糊精用量大,包合過(guò)程需要全程保溫,能耗較大,操作繁瑣,不利于工業(yè)生產(chǎn)。超聲法制備揮發(fā)油包合物時(shí),飽和溶液超聲冷卻后容易形成結(jié)晶析出,溶液表面有油滴,包合效果較差,包合率明顯低于飽和水溶液法和膠體磨法。而膠體磨法制備揮發(fā)油包合物揮發(fā)油利用率高、包合時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便,占用空間小、設(shè)備投入少,適合工業(yè)大量生產(chǎn)[9-11]。

工藝優(yōu)化方法應(yīng)用最多的是正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì),缺乏實(shí)驗(yàn)精確度,各因素交互作用考察不靈敏,建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性差。而本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法,通過(guò)多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性好,能夠準(zhǔn)確表示試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化結(jié)果,實(shí)驗(yàn)精確度較高。

因此,本實(shí)驗(yàn)使用膠體磨法包合荊防顆粒揮發(fā)油,并采用Box-Behnken設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)選得到揮發(fā)油包合的最佳工藝,結(jié)果表明,優(yōu)選的包合工藝穩(wěn)定可行,揮發(fā)油包合率和包合物得率均較高,分別為85.98%和92.51%,這為荊防顆粒發(fā)揮療效奠定基礎(chǔ)。