雷帕霉素靶蛋白調節自噬在理筋手法改善靜力性損傷中的作用機制研究

孫文靜 馬惠昇 穆靜 袁蘭英 宋斐 楊楠 魏曉歌

隨著社會的發展及工作壓力的增大,加之長時間勞損和不正確坐姿,頸肌勞損在年輕人中越來越普遍。頸肌勞損是一種局部軟組織損傷性疾病,屬于靜力性損傷的類型。靜力性損傷是指長時間固定某一動作而沒有得到及時充分的緩解及修復的一種損傷。長時間低頭工作或學習,頸肌勞損發生應力環境的改變,頸椎動靜力平衡破壞,導致頸椎小關節不穩以及周圍組織的炎性病變,影響頸交感神經正常功能的發揮,最終會發展為頸椎病[1]。臨床上發現,大部分青年患者影像學檢查并未見明顯病理征,但是頭暈、頭痛、視物模糊、血壓變化、頸部疼痛等交感神經興奮或抑制的臨床癥狀卻十分明顯和嚴重。因此,重視頸肌勞損并盡早治療顯得尤為重要。

本文通過家兔頸椎前屈造模,使頸部肌肉受到靜力性負荷,局部肌肉及血管受壓,血液循環減慢,形成缺血缺氧的微環境,代謝產物無法及時清理,產生堆積,從而引起肌肉損傷[2]。課題組前期研究發現,理筋手法可激活肌纖維骨架蛋白的表達,促進細胞骨架形態的修復,同時改善局部血液循環,促進炎癥吸收,恢復骨骼肌正常形態和功能[3]。本研究通過觀察不同時間點家兔一般情況、組織形態學變化、超微結構、自噬相關因子的蛋白表達變化及mRNA水平的變化,探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在理筋手法治療骨骼肌靜力性損傷過程中對骨骼肌過度自噬的抑制作用的機制研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組

6月齡日本大耳兔40只,體質量(2.0±0.6)kg,雌雄各半,實驗動物由陜西君行生物科技有限公司提供[許可證號:SCXK(陜)2017-001],飼養于寧夏醫科大學實驗動物房,常規分籠飼養。室溫為15～20℃,濕度為50%～60%,12小時/12小時明暗周期,自由飲食飲水。家兔適應性飼養1周后,根據隨機數字表法選取5只作為空白組(K組),剩余35只均予以頸肌屈曲造模,每日5小時,60天后隨機選取5只為模型組(M組)與空白組比較,驗證造模是否成功。剩余30只隨機分為模型組和手法治療組,每組15只。模型10天組(M10)、20天組(M20)和30天組(M30),均不予任何治療。治療組每日予以理筋手法治療,分別在第10天、20天、30天進行取材,即為治療10天組(Z10)、20天組(Z20)和30天組(Z30)。實驗過程中對動物的處置符合國家實驗動物福利倫理的相關規定,嚴格遵守寧夏醫科大學實驗動物福利倫理原則,實驗過程嚴格符合2006年中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待動物的指導性意見》,倫理學批號:2018-121。

1.2主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染色液(珠海貝索生物技術有限公司)、異丙醇(天津市永大化學試劑有限公司)、電鏡固定液(武漢谷歌生物)、丙酮(國藥集團化學試劑有限公司)、RIPA裂解液(北京索萊寶公司)、ECL發光試劑盒(中杉金橋公司)、PVdF膜(Millipore公司)、X射線膠片(CarestreaM公司)、山羊抗兔二抗(北京中杉)、山羊抗鼠二抗(北京中杉)、TriZol試劑(美國Invitrogen公司)、熒光定量PCR試劑盒(武漢莫奈生物科技有限公司)。

包埋機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)、石蠟切片機(德國徠卡儀器有限公司)、光學顯微鏡系統(日本奧林巴斯公司)、電鏡超薄切片機(德國徠卡儀器有限公司)、透射電子顯微鏡(日本日立公司)、低溫高速離心機(Eppendorf公司)、電泳儀(北京六一公司)、轉膜儀系統(ATTO公司)、酶標儀(芬蘭雷勃MultisKan)、移液器(吉爾森公司)、渦旋振蕩儀(其林貝爾儀器制造有限公司)、核酸蛋白定量儀(美國丹諾爾公司)、熒光定量PCR儀(美國BIO-RAd)。

1.3造模方法

參照劉志華[4]所改良的頸部模型固定架,建立兔頸部靜力性損傷模型。根據家兔體質量可適當調整固定架形狀,松緊度以不影響家兔正常呼吸為度,且四肢活動正常。固定后家兔頭頸前屈45°,每天持續5小時,連續60天,每日觀察家兔精神狀態、反應力、頸部觸覺、飲食飲水情況等。造模結束后取頸后肌進行HE染色,觀察肌纖維情況,與空白組對照以判定是否造模成功。

1.4干預方法

課題組前期研究中以家兔不抵抗為原則,明確了理筋手法力量參數且在手法測定儀上反復練習,將手法力量控制在2 kg。治療組均予以松筋、撥筋、順筋三種手法治療。松筋手法將大拇指和食指指腹著力于頸椎兩側肌肉,自上而下循環拿揉,頻率100次/分鐘,共5分鐘[5];撥筋手法以大拇指指腹著力于一側頸肩部肌肉,兩側交替反復進行撥動,頻率80次/分鐘,共5分鐘;順筋手法將兩手拇食指指腹著力于枕骨粗隆下,自上而下推捋頸部肌肉,頻率80次/分鐘,共5分鐘。

1.5取材及指標檢測

1.5.1 組織取材 造模60天后禁食12小時,耳緣靜脈空氣栓塞處死。在頸后肌分離出部分骨骼肌組織分別置于2%戊二醛及4%多聚甲醛中固定,以制備透射電鏡標本及進行HE染色。另取頸后肌組織各一塊,迅速放入液氮中凍存,以便后期進行免疫蛋白印跡(Western blot,WB)及實時熒光定量法(Quantitative real-time,PCR)的檢測。

1.5.2 HE染色觀察組織形態學 頸后肌標本在4%多聚甲醛中固定后梯度酒精脫水,固定包埋并制作切片(厚度為5 μm),常規脫蠟、脫水后放入蘇木素染色液中5分鐘,流水沖洗,鹽酸乙醇分化,繼續放入伊紅溶液染色,流水沖洗,梯度脫水后進行透明及中性樹脂封固。光鏡下觀察肌纖維、細胞核等組織形態學變化。

1.5.3 透射電鏡下觀察骨骼肌超微結構 2%戊二醛固定的頸后肌進行緩沖液沖洗后放入1%鋨酸中孵育過夜,梯度乙醇脫水,氧化丙烯浸透,環氧樹脂包埋,將包埋好的樣品制成超薄切片(60～80 nm),醋酸鉛鈾雙重染色,透射電子顯微鏡下觀察骨骼肌超微結構,并采集圖像分析。

1.5.4 WB法檢測頸后肌Bcl-2-腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2-adenoirus E1B 19-Kda interacting protein 3,BNIP3)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1-light chain 3,LC3)、核孔蛋白62(nucleoporin 62,P62)、P-mTOR蛋白表達 取50 mg組織將待測樣品研磨分裝于離心管中,加入250 μL的RIPA裂解液勻漿(使用前5分鐘加入蛋白酶抑制劑),4℃過夜裂解,提取蛋白。根據蛋白定量結果,加入蛋白樣品及裂解液,輕輕混合后95℃變性10分鐘。制備SdS-PAGE凝膠,依次進行蛋白上樣、電泳、轉膜,將轉移膜置于封閉液中,封閉后的膜放入一抗中,4℃孵育過夜(β-actin 1∶3000,P-mTOR 1∶800,BNIP3 1∶1200,LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶1000,P62 1∶1000),洗膜,放入二抗工作液中孵育90分鐘(山羊抗兔1∶3000,山羊抗鼠1∶3000),顯色曝光,膠片掃描后,用IMage J軟件測定條帶灰度值,進行分析。

1.5.5 PCR檢測BNIP3 mRNA、LC3Ⅱ/ⅠmRNA的表達 取50 mg組織研磨后加入1 mL的TriZol離心管中,振蕩混勻后靜置,加入氯仿混勻靜置,離心15分鐘(4℃,12000 rpm),取水相加異丙醇混勻冰浴,離心10分鐘(4℃,12000 rpm),冰乙醇沉淀混勻,離心5分鐘(4℃,12000 rpm)并干燥,加dEPC處理水溶解RNA,測濃度,調整濃度并計算上樣量,逆轉錄合成cdNA。取1ngcdNA,0.6 μL上、下游引物及10 μL反應液,配制RNA逆轉錄反應體系,定量PCR擴增,95℃ 15分鐘,95℃ 10秒,58℃ 30秒,72℃ 30秒,共40個循環,得到Ct值,根據公式計算樣本mRNA表達量。

1.6統計學方法

2 結果

2.1頸部靜力性損傷模型造模對家兔一般情況的影響

家兔造模前期較警覺,不易抓取,造模后期家兔萎靡不振,表情倦怠,蜷縮少動,飲食、飲水減少等。觸碰模型組家兔頸部時,家兔精神緊張、易躲閃,頸部肌肉較僵硬,可觸及條索狀物。

2.2理筋手法對家兔頸部靜力性損傷肌纖維組織形態學的影響

2.2.1 HE染色結果 細胞核呈藍色,細胞質呈紅色。空白組可見肌纖維排列整齊致密,細胞核呈卵圓形,形態規則,排列整齊,無組織水腫及炎性浸潤。模型組肌纖維排列紊亂,扭曲變形,肌間隙寬窄不一,可見大量炎性物質滲出。形態學結果提示家兔造模成功。模型10天組肌纖維腫脹變形,局部有斷裂,細胞核分布不均勻,大量炎性細胞浸潤。治療10天組肌纖維腫脹變形,肌間隙寬窄不一,較多炎性細胞浸潤。模型20天組肌纖維腫脹扭曲,炎性細胞較多。治療20天組,炎性細胞明顯減少,扭曲程度有所減輕。模型30天組肌纖維排列較前改善,炎性細胞有所減少。治療30天肌纖維排列整齊,肌間隙較均勻。見圖1。

2.2.2 透射電鏡結果 空白組可見肌絲排列整齊,肌節完整,明暗帶清晰,線粒體形狀規則,分布均勻;模型組肌絲嚴重扭曲變形,肌纖維溶解、斷裂,肌節模糊紊亂,Z線缺失;線粒體分布散亂,可見腫脹及空泡化;模型10天組肌絲扭曲變形,肌節模糊,線粒體腫脹,分布不均勻;治療10天組肌絲扭曲,變形,肌纖維斷裂,線粒體數量減少;模型20天組見肌纖維排列不整齊,部分Z線缺失,肌節縮短;治療20天組肌絲扭曲緩解,肌節相對完整,明暗帶較清晰,線粒體腫脹消失;模型30天組大部分肌絲扭曲變形,肌節紊亂,線粒體形態較完整;治療30天組肌絲排列較整齊,肌節完整,線粒體數量增多,形態正常。見圖2。

注:K:空白組;M:模型組;M10:模型10天組;M20:模型20天組;M30:模型30天組;Z10:治療10天組;Z20:治療20天組;Z30:治療30天組。

2.3各組家兔頸后肌P-mTOR、BNIP3、LC3、P62的蛋白表達

與空白組相比,模型組P-mTOR、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ表達量顯著升高(P<0.01),模型組P62表達量顯著降低(P<0.05)。與同一時間點模型組相比,各治療組P-mTOR表達量均顯著升高(P<0.05),各治療組BNIP3表達量均降低(P<0.05),治療10組、治療20天組LC3Ⅱ/Ⅰ表達量均顯著下降(P<0.01),治療10天組、治療20天組P62表達量均升高(P<0.05)。與治療10天組、治療20天組相比,治療30天組P-mTOR表達量顯著下降(P<0.01),與治療10天組相比,治療30天組BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ表達量顯著下降(P<0.01),治療20天組、治療30天組P62表達量均升高(P<0.05);治療20天組與治療10天組相比,P-mTOR表達量升高(P<0.05);不同時間點模型組P-mTOR表達量呈逐漸下降趨勢,治療組和模型組BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ均呈逐漸下降趨勢。見表1、圖3～4。

表1 各組家兔頸后肌組織LC3B/A、BNIP3、P62、P-mTOR的蛋白表達比較

注:K:空白組;M:模型組;M10:模型10天組;M20:模型20天組;M30:模型30天組;Z10:治療10天組;Z20:治療20天組;Z30:治療30天組。

注:K:空白組;M:模型組;M10:模型10天組;M20:模型20天組;M30:模型30天組;Z10:治療10天組;Z20:治療20天組;Z30:治療30天組。

2.4各組家兔頸后肌BNIP3、P62的mRNA表達

與空白組相比,模型組BNIP3 mRNA顯著升高(P<0.05),P62 mRNA顯著降低(P<0.05);與同一時間點模型組相比,治療組BNIP3 mRNA均顯著下降(P<0.05);與治療10天組組相比,治療30天組BNIP3 mRNA顯著降低(P<0.05),P62 mRNA顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組家兔頸后肌組織BNIP3、P62的mRNA水平比較

3 討論

頸部筋傷是指以肌肉、肌腱、韌帶為主的頸部軟組織受到損傷,出現疼痛、活動受限、頸椎失穩等的病理變化。《靈樞·刺節真邪》指出:“一經上實下虛而不通者,此必有橫絡盛加于大經。”可以看出,長時間的反復勞損會形成“橫絡”,繼而形成“筋結”,即局部軟組織出現粘連,進而形成結節、條索狀等病理改變[6]。理筋手法主要是通過松解肌筋、理筋止痛、正骨順筋等方式,治療頸部筋傷類疾病[7]。本次研究中采用松法、撥法、順法聯合,能夠解除筋結點的緊張痙攣,恢復經筋系統的平衡[8]。課題組前期研究發現,在治療頸部筋傷的臨床療效方面,通過麥吉爾疼痛問卷(McGill pain questionnaire,MPQ)評分量表發現理筋療法+針灸的治療效果要顯著優于單純針灸組[7]。實驗研究表明,理筋手法可降低兔頸肌損傷血清標志物,改善血液循環,減輕炎癥反應,激活肌纖維骨架蛋白的表達,促進細胞骨架形態修復[8]。本研究發現,通過光鏡和電鏡下治療組與模型組不同觀察點的比較發現,治療組恢復效果優于模型組,說明了理筋手法的干預對骨骼肌慢性損傷有改善作用。

自噬是一種由溶酶體驅動的,對自身異常和功能失調的細胞器、錯誤折疊的蛋白質沉積的自我清除過程[9]。骨骼肌長時間處于靜態負荷下,肌肉組織間壓力增大而出現血流緩慢,產生低氧的內環境,低氧環境刺激低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1),使其激活BNIP3,BNIP3被激活后使Beclin-1游離,從而調節下游Atg5蛋白[10],同時對LC3有很強的親和力,二者結合后激活自噬,過表達的BNIP3本身也可引起自噬。LC3為自噬的特征蛋白,分為Ⅰ型和Ⅱ型,通常以LC3-Ⅰ的形式存在,自噬發生時由Ⅰ型轉為Ⅱ型且表達增加,LC3-Ⅱ含量與自噬泡的數量成正比[11]。P62是自噬的重要受體之一,可與LC3相互作用,P62水平升高通常被認為是自噬活性受到抑制。因此,BNIP3蛋白與自噬因子LC3、P62等共同作用,能在低氧條件的影響下介導調控骨骼肌細胞自噬[12]。自噬過程受到哺乳動物mTOR通路和自噬相關基因家族(Atg)產物的調控[13]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,分為mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2),其中與自噬關系密切的是mTORC1,通過磷酸化ULK1和Atg13抑制細胞自噬,對自噬起負調控作用[14]。

骨骼肌靜力性損傷發生之后,損傷部位出現大量炎性因子浸潤,肌細胞內能量逐漸耗竭,體內代謝產物堆積,肌細胞代謝功能出現紊亂,激活自噬,清除受損的細胞器、變形的蛋白質以及炎性物質等,以此來維持內環境的穩定[15]。但由于長期保持固定姿勢而沒有進行及時有效的緩解,長時間的缺血缺氧導致能量消耗、廢物堆積,出現代謝超負荷,產生過度自噬。過度自噬會導致關鍵細胞成分的過分清除,蛋白質分解超過其合成[16],骨骼肌細胞受到損傷。此時,不平衡的自噬還導致肌核位置改變,從而觸發肌纖維變性[17],纖維蛋白丟失,骨骼肌質量下降,導致肌肉力量、韌性和彈性明顯減弱,即頸肌勞損時出現頸部硬結、條索及活動不利的癥狀。

本研究通過建立兔頸部前屈靜力性損傷模型,發現頸后肌群mTOR及BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62等自噬相關因子在造模前后均有變化,標志著靜力性損傷后自噬發生。經理筋手法干預后,各治療組的自噬相關因子變化水平較同一時間點各模型組變化幅度明顯,說明理筋手法干預對骨骼肌自噬有一定影響。如表1所示,P-mTOR表達量在治療20天時最高,說明此時mTOR抑制過度自噬的表現最明顯,骨骼肌細胞內可能處于及時調整及修復的狀態。隨著治療時間的增長,BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62等自噬相關因子的表達均有明顯變化,說明靜力性損傷形成后,自噬水平在理筋手法干預30天時最低,結合HE染色及透射電鏡下超微結構的變化,證明骨骼肌損傷的修復在治療30天時已處于穩定及平衡的狀態,損傷基本修復。

綜上所述,骨骼肌靜力性損傷后自噬發生,理筋手法干預促進mTOR信號通路的激活,進而抑制自噬活性,防止發生過度自噬,促進骨骼肌細胞結構和功能的恢復,加快促進骨骼肌損傷的修復。將細胞自噬通量維持在穩定且適合的水平對于保持細胞內環境穩態,保障機體的健康有著重要意義[18],其中涉及多個分子和代謝因素,且自噬通路較為復雜,除了mTOR通路,還包括AKt/FoxO3通路、Bcl-2/Beclin1通路等[19],不同通路之間呈網絡狀互相影響,其內在機制極其復雜和精細,有待進一步深入研究。