微管調(diào)節(jié)試劑對(duì)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子內(nèi)源激素及抗寒基因表達(dá)的影響

田海燕,馮秀英,徐明霞,董小云,鄭國強(qiáng),李 輝,王 瑩,魏家萍,武澤峰,崔俊美,譚雪蓮,劉自剛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070;2.武山縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,甘肅 天水 741300;3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究所,甘肅 蘭州 730070)

油菜是我國重要的油料作物,我國50%以上的食用油來源于油菜,同時(shí)油菜還是動(dòng)物飼料、蔬菜、綠肥和生物柴油等的重要來源[1]。長期以來,低溫脅迫是限制我國油菜產(chǎn)區(qū)北移和高產(chǎn)的主要非生物因素,嚴(yán)重影響我國油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。當(dāng)植物受到脅迫時(shí),細(xì)胞膜上的感受器會(huì)首先感知到外界低溫,植物接收到冷的信號(hào)后迅速調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗寒物質(zhì),啟動(dòng)抗寒基因的表達(dá),進(jìn)而激活相應(yīng)的代謝調(diào)控途徑,對(duì)植物產(chǎn)生保護(hù)屏障[2]。環(huán)境低溫信號(hào)與轉(zhuǎn)換是植物冷應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié),細(xì)胞膜是植物感受低溫最敏感的部位,由中間磷脂雙分子層構(gòu)成基本骨架,物質(zhì)通過細(xì)胞膜進(jìn)出,冷應(yīng)激均會(huì)引起細(xì)胞骨架重排[3]。細(xì)胞骨架是一類蛋白纖維網(wǎng)架體系,由微管、微絲及中間纖維組成,細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的物質(zhì)運(yùn)輸,同時(shí)細(xì)胞膜骨架整體結(jié)構(gòu)還影響細(xì)胞膜上不同通道的離子活性[4]。細(xì)胞骨架與跨質(zhì)膜的細(xì)胞外基質(zhì)互相聯(lián)結(jié),低溫作用于跨膜的胞外受體,然后將冷信號(hào)傳遞給細(xì)胞骨架,由細(xì)胞外信號(hào)傳遞給生命活動(dòng)的控制中心,進(jìn)而對(duì)下游相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控,形成了一個(gè)統(tǒng)一協(xié)調(diào)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

細(xì)胞骨架重組對(duì)冷誘導(dǎo)的胞質(zhì)Ca2+濃度的波動(dòng) (鈣信號(hào)) 非常重要,低溫脅迫后,質(zhì)膜生理狀態(tài)、Ca2+內(nèi)滲、相關(guān)質(zhì)膜蛋白等在冷信號(hào)感受和傳遞的上游途徑中發(fā)揮重要作用[5]。在冷脅迫初期,Ca2 +通道和質(zhì)膜蛋白CRLK1 / 2被激活,隨后Ca2 +信號(hào)和MAPK級(jí)聯(lián)途徑被激活,形成由胞外鈣庫向胞內(nèi)的跨膜Ca2+流。Ca2+流作為第二信使,通過MEKK-MPK激酶途徑和14-3-3s穿梭途徑,分別多泛素化ICE1和CBFs轉(zhuǎn)錄因子,從而調(diào)控冷信號(hào)通路核心位置ICE1-CBF-COR的途徑[6]。ICE1被MAPK級(jí)聯(lián)中的MPK3/6磷酸化,導(dǎo)致ICE1被降解,同時(shí),CRPK1磷酸化的14-3-3蛋白從胞漿穿梭到細(xì)胞核,促進(jìn)CBFs的降解,從而調(diào)節(jié)冷防御反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間,參與植物耐冷性通路[7]。CBF轉(zhuǎn)錄因子在低溫應(yīng)答調(diào)控中起關(guān)鍵作用[8]。擬南芥中有三個(gè)CBF基因,即CBF1、CBF2和CBF3,其中CBF1和CBF3直接感應(yīng)冷信號(hào),調(diào)控通路上的抗寒基因,低溫誘導(dǎo)OST1激酶的活性,ICE1和激活狀態(tài)的OST1互作使ICE1蛋白磷酸化,提高ICE1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,從而提高植物的耐冷性[9]。在冬油菜中抗凍蛋白(AFPs)具有抑制冰晶結(jié)合和生長能力,受ICE1-CBF冷信號(hào)通路的調(diào)控[4]。

秋水仙堿(Colchicine,Col)作為一種微管聚合抑制劑[10],可以改變細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程,阻斷染色體,使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異,當(dāng)Col與正在進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞相遇時(shí),秋水仙堿會(huì)與微管蛋白的特定位點(diǎn)結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的α微管蛋白結(jié)構(gòu)和β微管蛋白二聚體變形,微管蛋白組裝成微管的過程則會(huì)被明顯阻斷,使細(xì)胞停止于有絲分裂中期,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。紫杉醇(Taxol,Tax)是一種微管促進(jìn)和穩(wěn)定已聚合的微管劑,當(dāng)細(xì)胞與Tax接觸后,會(huì)在細(xì)胞體內(nèi)積累大量的微管,微管的積累會(huì)阻斷細(xì)胞分裂[12],進(jìn)而促進(jìn)或誘導(dǎo)微管蛋白聚合、防止解聚,從而能穩(wěn)定細(xì)胞微管的穩(wěn)定性[13]。因此,本研究利用微管調(diào)節(jié)試劑,即微管聚合抑制劑Col和微管聚合促進(jìn)劑Tax處理白菜型冬油菜萌動(dòng)種子,分析微管試劑對(duì)不同白菜型冬油菜萌動(dòng)種子相關(guān)內(nèi)源激素和抗寒基因的變化,為油菜出苗的抗寒防凍提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’為試驗(yàn)材料,‘隴油7號(hào)’種子由甘肅省干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室油菜課題組提供,‘天油4號(hào)’種子由天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選籽粒飽滿、大小均一的種子,先用75%的酒精消毒5 min,再用ddH2O沖洗種子3次,滅菌濾紙吸干附著水,發(fā)芽盒(12 cm×12 cm)中萌發(fā)種子,每盒播種100粒。播后將發(fā)芽盒置于SPX-GB型植物光照培養(yǎng)箱(光照強(qiáng)度600 μmol·s-1·m-2),每天光照16 h,晝/夜溫度(20±1)/(20±1)℃,相對(duì)濕度40%,每天澆2 mL 50%濃度的霍格蘭營養(yǎng)液。種子萌發(fā)5 d后,添加400 μmol·L-1的Col處理6 h,隨后用ddH2O水沖洗發(fā)芽盒3～5次,去除殘留Col溶液。然后將油菜萌動(dòng)種子放置于20℃和0℃溫度下分別處理12 h和24 h后采樣。對(duì)照添加等體積ddH2O,不加試劑處理。Tax處理時(shí),添加試劑為50 μmol·L-1的Tax處理,其他條件同Col處理。

1.3 內(nèi)源激素含量測(cè)定

采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent LC-MS,安捷倫公司,美國)測(cè)定試樣中赤霉素(gibberellin,GA3)、生長素(auxin,IAA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)和玉米素(zeatin,ZT)含量。

1.4 白菜型冬油菜中與細(xì)胞骨架相關(guān)抗寒基因的表達(dá)驗(yàn)證

使用TIANGEN公司的植物總RNA提取試劑盒提取白菜型冬油菜萌動(dòng)種子總RNA,用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和質(zhì)量,取OD260/280值介于1.9～2.1的RNA樣品,按TIANGEN FastQuant RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)體系比例要求將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA,測(cè)定濃度后稀釋至50 ng于-20℃保存?zhèn)溆谩腉eneBank中挑選出3個(gè)擬南芥中與細(xì)胞骨架相關(guān)的抗寒基因,即MKK2、α-tubulin、β-tubuli,根據(jù)這些抗寒基因在擬南芥序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information,https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行BLAST-X(https：//cipptato.org/genebankcip/)序列同源比對(duì),找到在白菜型油菜中高度同源的相關(guān)基因。除上述3個(gè)抗寒基因外,同時(shí)在白菜型油菜中找到冷調(diào)控通路上的關(guān)鍵基因(ICE1、CBF1)和抑制冰核形成抗凍蛋白編碼基因(BrAFP1)的同源序列。采用Primer 3 Input(http：/bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線軟件設(shè)計(jì)real-time PCR引物(表1)。以Actin基因作為內(nèi)參基因,引物由上海Sangon Biotech有限公司合成。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,95℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。待擴(kuò)增完成后,根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線檢測(cè)其特異性,并利用2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)PCR定量分析相關(guān)基因的引物序列Table 1 The primer sequence of corresponding genes that were used to real-time PCR analysis

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,不同試驗(yàn)處理下相應(yīng)生理性狀分別采用GLM(generalized linear model)模型進(jìn)行聯(lián)合方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微管調(diào)節(jié)試劑對(duì)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ABA含量的影響

由圖1可知,與20℃處理相比,0℃處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子ABA明顯上升,而Col處理具有降低萌動(dòng)種子ABA含量的作用,在0℃下更加明顯。在20℃處理下,與CK相比,Col處理對(duì)不同品種白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ABA含量的影響存在差異,在20℃處理12 h和24 h下,Col處理使‘隴油7號(hào)’萌動(dòng)種子ABA含量分別降低了5.26%和1.29%,而在12 h時(shí)Col處理使‘天油4號(hào)’ABA含量升高了4.19%,在24 h時(shí)Col處理使ABA含量下降了23.48%。在0℃處理下,Col處理能使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子ABA含量顯著下降,0℃處理12 h和24 h下,‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子ABA含量分別降低了55.68%、61.16%和11.22%、52.20%(圖1A)。

注：不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著。下同。Note：Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.The same below.圖1 不同白菜型油菜品種在不同時(shí)長、溫度和Col/Tax濃度處理下ABA含量Fig.1 The ABA content at different times,temperatures,and Col/Tax concentration treatments in different Brassica rape

Tax處理能使白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ABA含量明顯上升;20℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’ABA含量分別增加了76.02%、42.49%和26.35%、97.39%。在0℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Tax處理使ABA含量分別增加了17.84%、20.34%和13.53%、16.52%(圖1B)。綜上所述,低溫脅迫能使白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ABA含量明顯上升,Tax能夠促進(jìn)ABA的上升,Col能夠減緩萌動(dòng)種子ABA。

2.2 微管調(diào)節(jié)試劑對(duì)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子IAA含量的影響

由圖2可知,與20℃處理相比,0℃處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子IAA總體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì),與‘天油4號(hào)’相比,‘隴油7號(hào)’的變化趨勢(shì)更加明顯(圖2A);與CK相比,Col處理使萌動(dòng)種子IAA含量明顯降低。在20℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Col處理能使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子IAA含量顯著下降,分別降低了31.17%、83.68%和47.02%、24.69%;在0℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Col處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子IAA含量分別降低了65.56%、78.76%和61.28%、35.70%。

在Tax處理下,除‘隴油7號(hào)’在20℃處理12 h時(shí)IAA含量降低了37.01%,其他處理下兩個(gè)油菜品種萌動(dòng)種子的IAA含量都表現(xiàn)出不同程度的升高(圖2B)。在0℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’IAA含量分別上升了55.11%、33.30%和64.13%、421.75%。在20℃處理12 h下,與CK相比,Tax處理使‘天油4號(hào)’IAA含量上升了65.61%;在20℃處理24 h下,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’IAA含量分別上升了75.52%和241.98%。綜上所述,低溫脅迫能使白菜型冬油菜萌動(dòng)種子IAA含量明顯上升,Tax能夠促進(jìn)萌動(dòng)種子體內(nèi)IAA含量增加,Col能夠減緩萌動(dòng)種子IAA的產(chǎn)生。

2.3 微管試劑處理對(duì)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子GA3含量影響

由圖3可知,與20℃處理相比,0℃處理后,‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子GA3含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且‘天油4號(hào)’的下降趨勢(shì)明顯強(qiáng)于‘隴油7號(hào)’;與CK相比,Col處理能使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子GA3含量明顯下降。在20℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Col處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’GA3含量分別降低了34.54%、43.74%和14.61%、30.59%;在0℃處理12 h和24 h下,Col處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’GA3含量分別降低了47.01%、53.49%和31.95%、26.82%(圖3A)。

圖3 不同白菜型油菜品種在不同時(shí)長、溫度和Col/Tax濃度處理下GA3含量Fig.3 The GA3 content at different times,temperatures,and Col/Tax concentration treatments in different Brassica rape

與CK相比,Tax處理能使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子GA3含量明顯上升(圖3B)。在0℃處理12 h和24 h下,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’GA3含量分別上升了18.26%、16.84%和24.97%、51.74%。在20℃處理12 h下,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’的GA3含量明顯上升,分別增加了9.71%和21.66%。而在20℃的處理24 h下,‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子的GA3含量在處理前后基本無變化。綜上所述,在低溫脅迫下使白菜型冬油菜萌動(dòng)種子GA3含量明顯下降,Tax處理對(duì)GA3產(chǎn)生具有顯著的促進(jìn)作用,而Col能夠減緩萌動(dòng)種子GA3的產(chǎn)生。

2.4 微管試劑處理對(duì)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ZT含量影響

由圖4可知,與20℃處理相比,0℃處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子ZT呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì),而Col處理能夠減緩ZT的產(chǎn)生(圖4A)。在20℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Col處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子ZT含量分別降低了8.57%、70.72%和5.01%、8.57%。在0℃處理12 h和24 h下,Col處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’ZT含量分別降低了39.35%、86.80%和49.20%、85.77%。

圖4 不同白菜型油菜品種在不同時(shí)長、溫度和Col/Tax濃度處理下ZT含量Fig.4 The ZT content at different times,temperatures,and Col/Tax concentration treatments in different Brassica rape

與CK相比,Tax處理能使白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ZT含量明顯上升(圖4B)。在20℃處理12 h和24 h下,與CK相比,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’ZT含量分別增加了6.89%、17.28%和11.15%、41.56%。在0℃處理12 h和24 h時(shí),與CK相比,Tax處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’ZT含量分別增加了11.24%、10.30%和12.79%、12.80%。表明低溫脅迫能夠促進(jìn)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子ZT的產(chǎn)生,Tax能夠促進(jìn)ZT含量的上升,Col能夠減緩萌動(dòng)種子ZT的產(chǎn)生。

2.5 微管調(diào)節(jié)試劑處理對(duì)白菜型冬油菜抗寒基因表達(dá)的影響

由圖5可知,在0℃與20℃處理下,Col試劑處理使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’MKK2、α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1基因的表達(dá)量顯著高于Tax試劑處理。不同品種間比較發(fā)現(xiàn),添加Col試劑后,與0℃處理12 h相比,0℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’MKK2、α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量分別上升了102.7%、248.1%、195.4%、72.98%、11.00%、274.4%;‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、CBF1的表達(dá)量分別上升了39.31%、17.21%、39.69%,MKK2、ICE1、BrAFP1的表達(dá)量分別下降了17.80%、52.68%、92.48%。添加Tax試劑后,與0℃處理12 h相比,0℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’MKK2、α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量分別下降了100%、99.50%、99.90%、99.37%、32.47%、92.05%;‘天油4號(hào)’MKK2、α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量分別上升了79.99%、208.8%、169.5%、94.05%、44.79%、78.62%。添加Col試劑后,與20℃處理12 h相比,20℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’MKK2、α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量分別上升了601.9%、329.3%、303.5%、228.6%、24.84%、440.6%和79.77%、3.28%、1.18%、12.72%、10.10%、168.0%;添加Tax試劑后,與20℃處理12 h相比,20℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’MKK2、α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量分別下降了54.46%、32.85%、31.50%、47.76%、22.61%、11.77%和54.39%、54.45%、46.96%、75.59%、31.91%、76.13%。

圖5 微管調(diào)節(jié)試劑處理對(duì)白菜型冬油菜萌動(dòng)種子抗寒基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of microtubule reagent treatment on cold resistance gene expression in seedling of winter rapeseed

3 討 論

3.1 微管調(diào)節(jié)試劑Col和Tax對(duì)白菜型冬油菜內(nèi)源激素的影響

植物內(nèi)源激素對(duì)植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用,當(dāng)植物在受到低溫脅迫時(shí),會(huì)受到多種激素的共同調(diào)節(jié),增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的抵抗能力[14]。研究表明,ABA在冷脅迫中可以促進(jìn)植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加[15],從而穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),通過ICE1-CBF冷信號(hào)通路誘導(dǎo)下游抗寒基因表達(dá)等作用,從而提高植物對(duì)低溫的抵御能力[16]。前人在小麥[17]、茶樹[18]及玉米[19]等作物中研究表明,ABA可以提高植物的抗寒性。GA3能降低自由水含量,維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,GA3含量升高可以提高植物的抗寒性[20]。IAA的代謝也會(huì)影響植物的抗寒性[21],在一定的低溫處理下,IAA含量升高可以提高油菜的抗寒能力[22]。ZT含量增高會(huì)加速植物新陳代謝和蛋白質(zhì)的合成,使有機(jī)體迅速增長,從而提高植物抗寒能力,減輕低溫對(duì)植物的傷害[23]。本研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源激素在不同油菜品種、不同微管調(diào)節(jié)試劑、不同溫度和處理下均存在一定差異。施加Tax試劑后,在0℃與20℃處理下會(huì)引起‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’ABA、IAA、GA3和ZT含量顯著上升,施加Col試劑則使‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’ABA、IAA、GA3和ZT含量下降。說明施加Col和Tax試劑會(huì)影響白菜型油菜萌動(dòng)種子內(nèi)源激素含量。

3.2 微管調(diào)節(jié)試劑Col和Tax對(duì)白菜型冬油菜抗寒基因表達(dá)量的影響

在低溫脅迫下MAPK級(jí)聯(lián)起著重要的作用,典型的MAPK級(jí)聯(lián)包含三種蛋白激酶(MAPKKK、MAP3K或MEKK)、MAPK激酶(MAP2K、MKK或MEK)和MAP激酶(MAPK),其中MKK2與MPK4(MAPK4)和MPK6(MAPK6)相互作用來調(diào)節(jié)MKK2的活性,同時(shí)MKK2還誘導(dǎo)CoR基因的表達(dá)[24]。ICE1與CBF基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合激活表達(dá),CBF結(jié)合到其下游目的基因啟動(dòng)子的DRE序列上,誘導(dǎo)COR的表達(dá),從而提高植株的抗寒性[25]。α-微管蛋白和β-微管蛋白是植物微管蛋白的主要組成部分,也是細(xì)胞骨架的重要組成部分,植物微管蛋白基因會(huì)受溫度調(diào)控[26]。低溫下α-微管蛋白表達(dá)上調(diào)會(huì)維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性[27]。微管在抗寒中的作用與植物的部位以及溫度有很大的關(guān)系[28]。AFPs具有修飾冰晶形態(tài),可以抑制冰晶的生長和重結(jié)晶等作用,在抵御外界低溫凍害中具有重要作用,可以提高植物的抗寒性[29]。本研究發(fā)現(xiàn),抗寒基因在不同油菜品種、不同微管調(diào)節(jié)試劑、不同溫度和處理下均存在差異。添加Col后,0℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、MKK2、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量明顯升高,‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、CBF1的表達(dá)量上升,但MKK2、ICE1、BrAFP1的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì);20℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、MKK2、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)。添加Tax后,0℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量被下調(diào),‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì);20℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、MKK2、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。說明施加Col和Tax試劑會(huì)影響白菜型油菜萌動(dòng)種子抗寒基因的表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn),Col能夠降低‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子的ABA、IAA、GA3和ZT含量,而Tax能夠增加‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’萌動(dòng)種子的ABA、IAA、GA3和ZT的含量。添加Col后,與0℃處理12 h相比,0℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、MKK2、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量上調(diào),‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、CBF1表達(dá)量上調(diào),但MKK2、ICE1、BrAFP1的表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào);與20℃處理12 h相比,20℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、MKK2、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量均上調(diào)。添加Tax后,與0℃處理12 h相比,0℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量均下調(diào),‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量均上調(diào);與20℃處理12 h相比,20℃處理24 h時(shí),‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’α-tubulin、β-tubulin、MKK2、ICE1、CBF1、BrAFP1的表達(dá)量均下調(diào)。表明Col和Tax能使白菜型冬油菜細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,影響白菜型冬油菜萌動(dòng)種子內(nèi)源激素的含量及抗寒基因的表達(dá)。