絡石藤治療類風濕關節炎的作用機制研究

李勝，溫琦

1 山西中醫藥大學研究生院 山西太原 030024

2 山西省中西醫結合醫院 山西太原 030013

人體自身免疫系統疾病有很多種，其中類風濕關節（Rheumatoid Arthritis，RA）是大家所常見的，這也是屬于多系統炎癥性的。主要是累及周圍關節的、慢性、對稱性、進行性多關節炎是RA的主要特征，通俗表現為受累關節疼痛、腫脹、功能障礙，同時這種病變會呈現出長時間持續和反復發作的過程[1]。若RA早期沒得得到及時恰當的治療，最終會出現關節畸形和功能喪失等嚴重后果。目前，全世界約有 1% ～2%的人深受RA的困擾，嚴重影響人們的健康和生活質量，但其致病機制尚未完全明晰[2]。在治療RA的藥物上醫生有許多選擇，主要將其可劃分為四大類，有抗風濕藥（DMARDs），甾體類抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質激素以及生物制劑。短時間內控制病情，改善癥狀是這幾類藥物的優點。但它們也存在著副作用較多、費用較高、單一作用受限等缺點[3]，因此，尋找具有低毒、效好、價廉以及能夠長期服用等優點的 RA 藥物，日漸成為研究需要。中醫藥很早之前就有關于類風濕關節炎（RA）的相關記載，“痹”字這一出現最早來自于《黃帝內經》，當時對于“痹”的理解是——“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，就是以后大家所稱“歷節、歷節風”等也可指類風濕關節炎，因此對于類風濕關節炎的治療，中醫可謂是經驗豐富。絡石藤（Caulis）是在我國中藥一直占有一席之地，在古代時就已經被人們稱之為上品，并且早在《神農本草經》中留下自己寶貴的地位身影。絡石藤的有關知識可以從2015年版 《中國藥典》[4]系統得知，絡石藤是一種干燥帶葉藤莖，其分類為夾竹桃科植物，它性平和，味道微苦且溫，是非常重要的抗風濕清熱藥。功能表現主要分為兩個方面，一是涼血消腫，還有就是祛風通絡，在醫治常見的各種熱痹風濕或者腰膝酸痛、癰腫等病癥都可以發揮良好的功效。在現代臨床中也不乏看到絡石藤的影子，尤其是用于治療具有風濕熱證的類風濕性關節炎、關節炎等疾病。經過一系列的藥理學研究，學者發現了絡石藤作為祛風濕類中藥的作用機理，除了最簡單的可以抗菌消除炎癥減輕疼痛，最深層次的是可以有效控制身體內細胞凋亡，以及調控全身的免疫-抑制異常[5]。本文旨在通過網絡藥理學的方法和分析手段，預測絡石藤對疾病作用的可能機制；以及探索其物質基礎，以求對進一步研究絡石藤治療 RA提供理論依據。

材料與方法

1 絡石藤活性成分的篩選

中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/index.php）是我們本次需要用到的數據庫，是我們做中草藥系統計算的獨特藥理平臺，亦是國內相對完備的中藥成分靶點數據庫，運用TCMSP數據庫檢索出絡石藤的藥物成分，對藥物成分以需要的篩選標準去進行選擇，如化合物口服生物利用度要大于一定的數值（OB≥30%），類藥性指數要大于標準（DL≥0.18），最終得到9個所需要的活性成分，下載并保存這些活性成分相應的靶蛋白數據。

2 藥物靶點轉換

將通過篩選得到的活性成分的靶蛋白經過Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫轉換成標準的基因名稱。

3 疾病（RA）相關靶點基因的獲取

將“Rheumatoid Arthritis”作為關鍵詞，輸入DISGENT（https：//www.disgenet.org/）數據庫中，獲取類風濕關節炎（RA）的相關靶點以及其在Uniprot數據庫中對應的標準基因名。

4 藥物有效成分和疾病（RA）共同靶點的篩選

將篩選標化后的絡石藤活性成分靶基因以及類風濕關節炎（RA）相關靶基因同時輸入Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在 線作 圖軟件，構建韋恩圖，得到二者的交集基因。

5 藥物（絡石藤）-化合物-疾病（RA）-靶點網絡構建

為使絡石藤與類風濕關節炎（RA）潛在靶點間的相互作用進一步明確，將通過韋恩圖得到的交集基因，運用 Cytoscape3.9.1（https：//cytoscape.org/）構建“絡石藤-化合物-靶點-類風濕關節炎”的網絡圖，并進行可視化分析。

6 靶蛋白相互作用（PPI）網絡的構建

將絡石藤與RA的共同靶點基因上傳至String（https：//string-db.org/）軟件，獲取 PPI網絡數據。從所得到的數據中取前排名20的degree值的關鍵靶點基因，通過Cytoscape 3.9.1軟件繪制相互作用網路，并對其進行分析。

7 基因本體論（GO）及京都基因與基因百科全書（KEGG）通路富集分析

將交集基因（絡石藤-RA）輸入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）數據庫，結合利用GO功能分析和KEGG通路富集進行分析研究，把閾值設置為P＜0.05，并且按照涉及的靶點的數量多少從高到低排序，各篩選出前10個條目，包括GO富集分析分子功能（MF）、細胞組成（CC）及生物過程（BP）的，KEGG取前20個信號通路，進行圖表分析，以探求絡石藤-抗類風濕關節炎（RA）的生物學過程及信號通路。

結 果

1 絡石藤有效活性成分的篩選

以OB≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，通過TCMSP數據庫共獲得藥物（絡石藤）9個有效活性成分（表 1）。

2 藥物活性成分作用基因和RA基因的交集

將通過篩選后獲得的絡石藤（Caulis）的活性成分的靶蛋白，再經過Uniprot數據庫自有的轉換操作，變成相對應的基因名稱。然后通過DISGENT數據庫，獲取類風濕關節炎（RA）的相關靶點以及其在Uniprot數據庫中對應的標準基因名，共2722個。利用Venny 2.1在線作圖軟件將絡石藤對應有效活性成分（Caulis Trachelos ）與之相對應的109個靶點基因與RA對應的2722個靶點基因進行交集。獲得57個共有靶點基因。（見圖1）。

圖1 藥物靶點蛋白基因-疾病基因的韋恩圖

3 構建藥物-有效成分-靶點基因-疾病的網絡

結合應用Cytoscape 3.9.1 軟件，將所得到的57個共同靶點基因數據處理后，繪制構建絡石藤-有效成分-靶點基因-疾病（RA）的網絡圖。其中紫色矩形代表靶點基因，綠色橢圓代表疾病，藍色菱形代表mol id（各mol id代表活性成分見表1），橙色三角形代表藥物。（見圖2）。篩選出度值較大的節點進行研究分析，發現57個基因中排名前5位的化合物依次按數量分為木犀草素（36個靶點蛋白）、豆甾醇（12個靶點蛋白）、老刺木精（9個靶點蛋白）、依波加因（9個靶點蛋白）、去甲漢黃芩素（6個靶點蛋白）。該網絡表明絡石藤可能通過以上活性成分，進行靶點基因蛋白反應，從而發揮治療RA的作用。

表1 符合篩選標準 OB 和 DL 的活性化合物表

圖2 絡石藤-有效成分-靶點基因-類風濕關節炎網絡圖

4 靶點、關鍵基因PPI網絡構建與分析

將韋恩圖獲得的絡石藤與RA的57個交集基因上傳至String軟件，獲取PPI網絡數據。將所得數據處理后，取前20個在degree值的關鍵靶點基因，利用Cytoscape 3.9.1軟件繪制成所需要的相互作用網絡圖（見圖3），在下方圖中可以清晰地看到，degree值越大，填充顏色越深（此圖包括20個節點和183條邊）。基因與degree值的柱狀圖見圖4。其中degree值最高的為 AKT1，為 90；其次為 TP53，degree值為 84；TNF，degree值為80；IL6，degree值為76。表明絡石藤治療RA只要涉及這些蛋白基因，并且degree值越大的蛋白基因越有可能在治療過程中起著關鍵作用。

圖3 基因與degree值柱狀圖

圖4 靶蛋白PPI網絡圖

5 GO生物功能分析

GO即是Gene Ontology的簡稱，其包括生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）。本研究討論是通過DAVID數據庫為基礎，將閾值P設定為＜0.05，得到GO 功能富集分析顯示 394 個生物過程（BP）、41 個細胞組成（CC）、70 個分子功能（MF）；分別對BP、CC及MF的前10個條目進行可視化分析，得到圖5。如圖可見，靶基因在CC中，主要富集條目涉及細胞膜、細胞質及細胞核、細胞間隙等；靶基因在BP中，主要富集條目涉及細胞增殖的正向調整控制、基因表達的正向調控，RNA、DNA的轉錄、凋亡過程的調控等；靶基因在MF中，主要富集條目涉及分子蛋白結合、DNA結合、細胞因子活性、酶及復合物結合等。

圖5 絡石藤對RA治療的GO分析（包括BP、CC、MF）柱狀圖

6 KEGG信號通路富集分析

通過DAVID數據庫，并以P＜0.05為閾值，得出與類風濕關節炎密切相關的通路（取前20），利用微生信得到KEGG氣泡圖，并進行可視化分析，見圖6。前20條通路顯示多為癌癥、感染、炎癥及免疫等相關通路。推測絡石藤主要通過調控上述關鍵基因，從而影響上述信號通路的作用，以達到治療醫治類風濕關節炎（RA）的目的。

圖6 KEGG通路氣泡圖

討 論

作為一種常見性的疾病，RA也有自己的特殊性，它是具有一種全身性自身免疫性的疾病。 RA的外在病狀表現為手腕或者腳腕等對稱性受累小關節，以一種長期疼痛、腫脹伴隨著功能下降顯示出來，是一種侵蝕性關節炎[6]。多屬“痹證”辨治范疇。中醫學并無“類風濕關節炎”病名，但有類似“痹證”“尪痹”“歷節風”等論述，由此可見中醫藥對于治療類風濕關節炎等類似癥狀具有豐富的經驗。而網絡藥理學作為一個新興工具，近年來發展的十分迅速，其對于中藥有效活性成分的分析以及對疾病作用的預測具有十分重要的意義。

本次網絡藥理學研究從絡石藤-有效成分-靶點基因-疾病網絡圖中可以看出，對于類風濕關節炎（RA）起治療作用的活性成分，絡石藤中主要以木犀草素、豆甾醇、依波加因以及老刺木精為主。這里面木犀草素（luteolin）的作用非常大，其化學全稱為 3'，4'，5，7-四羥基黃酮。顧名思義它屬于黃酮類化合物的一種，可以從木犀草的莖、葉、枝中經過一系列物理化學操作中提取分離出來，名木犀草素[7]。木犀草素大都存在于多種藥材和常見的蔬果中，比如菊花和金銀花等其他，并且多以糖苷的形式存在[8-9]。在探索木犀草素的藥理活性研究中，不少研究學者也有不同的發現，除了已經被熟知的抗炎和抗菌作用，木犀草素在不僅可以有抗氧化的功能，在抵抗腫瘤和病毒等方面也做出了巨大貢獻[10-13]。

木犀草素作為一種黃酮類化合物，免疫細胞（其中主要是巨噬細胞）是其發揮抗炎活性的主要場所。對于黃酮類化合物來說，實現巨噬細胞炎性反應的抑制活性可通過抑制核轉錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路來實現[14]。同時一系列的研究表明抗炎、抗氧化及抗腫瘤等是豆甾醇的主要功能。Gabay等的研究發現，豆甾醇減少RA引起的軟骨退化，是通過控制減少多種炎癥介質的出現，和基本的基質降解[15]。其中一部分是通過阻礙IL-1B引導NF-kB通路來使其起到控制減少的作用。除此之外Chen等還通過一系列實驗揭秘了在兔關節炎模型中豆甾醇可以有軟骨降解的用途，然后對進行了詳細分析，包括膝關節的形態組織、基因形態和組織學等[16]。得出了最終結論：豆甾醇在一定程度上可以明顯抑制基質金屬蛋白酶的基因表達（MMPs），比如在軟骨關節炎（OA）中可以檢測得出，編碼基質金屬蛋白酶的基因表達（MMPs）高于正常的基準相，而且基質金屬蛋白酶的組織抑制劑-1（TIMP-1）也是顯著減少的。這些結論向我們說明：在治療類風濕關節炎（RA）的研究中，豆甾醇可能會發揮一定的用處。根據本研究結果以及相關文獻[17]可知，絡石藤主要通過木脂素類、甾體醇和黃酮類這些相應的化合物對類風濕關節炎（RA）產生作用。本探究中絡石藤與疾病RA共有57個交集靶點基因，主要參與對細胞分子的活性的影響，酶、分子蛋白及復合物的結合，調節DNA、RNA的轉錄，調控細胞的產生與增殖，調控細胞的凋亡以及基因的表達等。根據PPI網絡圖及基因與degree柱狀圖中可以看出，絡石藤中對類風濕關節炎（RA）起治療作用的自由度最高的前四靶點基因為AKT1、TP53、TNF以及IL6。一系列研究表明T、B淋巴細胞，細胞因子，細胞凋亡及蛋白酶等在類風濕性關節炎（RA）的發病過程中起著重非常重大的作用，其中越來越收到重視的是是炎性細胞因子在RA發病過程中的所產生的作用[18]。AKT1基因發揮著調控細胞增殖與生長的作用。其主要通過參與包括調控細胞凋亡以及控制葡萄糖代謝在內的細胞過程從而影響RA的病變進程；而同樣TP53也是因為影響機體的免疫和炎性反應來作用于RA，擁有基因翻譯功能的P53蛋白是在人體內重要的調節因子，不僅可以調整控制細胞的生長狀態和增殖凋亡狀態，還能對細胞損傷進行修復。還有一種關鍵的細胞因子——腫瘤壞死因子（TNF），不僅可以誘導包括細胞凋亡、炎癥，還可以影響免疫在內的廣泛的細胞內信號通路。不少研究都發現表明，在 RA 患者的患病組織滑膜以及關節滑液中檢測到TNF表達有明顯數字上升，這些都可以引誘并滑膜中的各種細胞發生變化，如軟骨細胞、破骨細胞，滑膜細胞和巨噬細胞等，哪怕這些變化很細微，但也都會影響關節內部微環境的狀態，最終呈現類風濕關節炎（RA）關節不同的破壞程度[19]。作為一種抑炎和抗炎因子的IL-6，在 RA 的發病過程中是不可忽視的一部分，細胞內的蛋白激酶在這種因子不斷刺激T 細胞、破骨細胞和滑膜細胞的作用下，導致不同于日常的激活狀態，加上過度的信號傳導，相關基因因此被過量表達，達到影響疾病（RA）結果[20]。

綜上，本研究通過網絡藥理學方法與軟件技術，搜集到絡石藤的活性成分及相關的靶點基因，以及與獲得的RA的靶點基因相交集。通過對這些交集靶點基因進行藥物-化合物-靶點-疾病網絡分析、GO富集以及KEGG富集分析，找出絡石藤治療類風濕關節炎（RA）的關鍵靶點與通路。絡石藤可能調控癌癥相關通路、細胞凋亡通路、P53信號通路等通路，控制減少炎性反應、調節身體的免疫功能以及調控細胞凋亡等相關作用來實現人們治療類風濕關節炎這一病癥的目標。最后，本方向研究尚且存在一定的局限性；因各平臺數據庫數據的完善更新程度不盡相同，相應分析計算方法和軟件功能有所區別等，都會對實驗得出的結論造成不同的影響。所以這次分析研究得出的結果都是以理論和網絡收集數據所支撐，僅可作為相關的實驗研究線索來源，還需要對其進一步的實驗驗證來探究最根本的作用機理，以待對臨床應用奠定理論基礎。