強(qiáng)筋小麥貯藏蛋白的積累動(dòng)態(tài)、種類及相對(duì)含量分析

房春豪 韓冉 毛鳳鑫 汪曉璐 徐文競(jìng) 王開(kāi) 祁廣 曹新有 李豪圣 劉愛(ài)峰 劉成

關(guān)鍵詞：強(qiáng)筋小麥；中筋小麥；麥谷蛋白；醇溶蛋白；谷蛋白大聚合體（GMP）

小麥籽粒主要由淀粉、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成。根據(jù)蛋白質(zhì)組分在不同溶劑中的溶解性，將小麥籽粒蛋白分為溶于水的清蛋白、溶于稀鹽的球蛋白、溶于70%乙醇的醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿的麥谷蛋白。麥谷蛋白是一種非均質(zhì)的大分子聚合體，是由多個(gè)亞基通過(guò)分子間二硫鍵相互交聯(lián)形成的多聚體，按其在SDS-PAGE中的遷移率，又分為高分子量麥谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）。谷蛋白聚合體主要由HMW-GS和LMW-GS通過(guò)鏈間二硫鍵鏈接而成，其在非解離狀態(tài)下，由一系列分子量大小不同的聚合體組成。谷蛋白聚合體中，不溶于SDS的谷蛋白聚合體分子量較大，稱之為谷蛋白大聚合體（GMP），其含量反映了谷蛋白聚合體的粒度分布。研究發(fā)現(xiàn)谷蛋白大聚合體含量越高，面筋的強(qiáng)度和彈性越大。

小麥面粉生產(chǎn)及產(chǎn)品加工質(zhì)量的高低與籽粒蛋白質(zhì)含量及其數(shù)量密切相關(guān)。其中，醇溶蛋白和麥谷蛋白的組成、含量和比例影響著小麥面筋的品質(zhì)。麥谷蛋白決定面筋的彈性，醇溶蛋白決定面筋的黏性和延展性。麥谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋并以一定的比例結(jié)合時(shí)，才共同賦予面團(tuán)特有的性質(zhì)。不同小麥品種麥谷蛋白和醇溶蛋白的含量和比例不同，從而導(dǎo)致面團(tuán)彈性和延展性的差異。近幾年發(fā)現(xiàn)一種半胱氨酸殘基含量高冗余的新型小麥籽粒蛋白Avenin-like蛋白，該類蛋白以其富含半胱氨酸（cys）殘基之特性被廣泛關(guān)注。由于半胱氨酸（cys）是形成蛋白質(zhì)二硫鍵的基礎(chǔ)，其位置及數(shù)量影響二硫鍵的形成。因此，對(duì)Avenin-like蛋白的深入研究將對(duì)分子水平小麥品質(zhì)改良具有重要意義。

濟(jì)麥229、濟(jì)麥44和濟(jì)麥22為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成的小麥品種，其中濟(jì)麥229和濟(jì)麥44為優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥，其高分子量麥谷蛋白亞基組合均為（1，7+8，5+10），在首屆黃淮麥區(qū)優(yōu)質(zhì)小麥鑒評(píng)會(huì)上均被評(píng)為超強(qiáng)筋小麥品種（全國(guó)僅4個(gè)）。濟(jì)麥22為高產(chǎn)、廣適、中筋小麥品種，其高分子量麥谷蛋白亞基組合為（7+8，4+12）。本研究以這3個(gè)小麥品種為試材，分析其籽粒發(fā)育期谷蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白聚合體的形成規(guī)律，確定影響小麥面筋品質(zhì)性狀形成的關(guān)鍵時(shí)期，了解品質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制，并通過(guò)TMT蛋白組學(xué)分析3個(gè)小麥品種成熟籽粒貯藏蛋白的量及優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥中貯藏蛋白的差異，為我國(guó)小麥品質(zhì)改良和優(yōu)質(zhì)小麥生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種濟(jì)麥229、濟(jì)麥44以及高產(chǎn)、中筋小麥品種濟(jì)麥22，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥遺傳育種團(tuán)隊(duì)育成并提供，于2018-2019年種植在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥育種試驗(yàn)基地（濟(jì)南）。于小麥開(kāi)花期掛牌標(biāo)記開(kāi)花一致的單穗200個(gè)，花后每5天取標(biāo)記穗20個(gè)，取籽粒晾曬，保存?zhèn)溆谩Ｗ蚜Ｄブ撇捎肍OSS旋風(fēng)式磨。

1.2測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1蛋白含量測(cè)定利用丹麥福斯1241公司生產(chǎn)的近紅外谷物分析儀測(cè)定。

1.2.2籽粒GMP含量測(cè)定

稱取250mg面粉置于50 mL離心管中，加入0.5%（W/V） SDS-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.9） 23 mL，渦旋振蕩20s，至完全分散，再用恒溫混勻儀30℃下以1000r/min攪拌5min，恒重后以11600×g離心力、30℃離心30min，棄上清液，所剩沉淀于115℃烘至絕干后稱重。烘干后的沉淀用MM400冷凍研磨儀研磨，采用杜馬斯定氮儀測(cè)定籽粒GMP含量。

1.2.3醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取及含量測(cè)定

醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取參考楊學(xué)舉的方法。取0.1g面粉樣品置人離心管中，加70%乙醇10mL，充分?jǐn)嚢韬笳袷?0min，4000r/min離心5min，取上清，同樣方法共連續(xù)提取3次后合并上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容，待測(cè)醇溶蛋白。麥谷蛋白用0.5%KOH提取，方法過(guò)程與提取醇溶蛋白相同。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4成熟籽粒不同類型貯藏蛋白量的測(cè)定3個(gè)品種成熟籽粒貯藏蛋白量的測(cè)定采用TMT蛋白測(cè)定技術(shù)．由杭州景杰生物科技股份有限公司完成。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1強(qiáng)筋小麥籽粒醇溶蛋白的積累動(dòng)態(tài)

對(duì)3個(gè)小麥品種醇溶蛋白的含量進(jìn)行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，籽粒發(fā)育過(guò)程中其醇溶蛋白的積累動(dòng)態(tài)均呈持續(xù)上升的變化趨勢(shì)。花后5～15天，隨灌漿時(shí)間推進(jìn)，籽粒醇溶蛋白含量增速較快，花后15～25天增速稍平緩，花后25～35天增速又加快。總體來(lái)看，整個(gè)籽粒灌漿期，強(qiáng)筋小麥濟(jì)麥44和濟(jì)麥229的醇溶蛋白含量均高于中筋小麥濟(jì)麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基類型上看，整個(gè)籽粒灌漿期，5+10亞基組合的醇溶蛋白含量均高于4+12亞基組合。

2.2強(qiáng)筋小麥籽粒麥谷蛋白的積累動(dòng)態(tài)

對(duì)3個(gè)小麥品種麥谷蛋白的含量進(jìn)行分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，籽粒發(fā)育過(guò)程中麥谷蛋白的積累動(dòng)態(tài)呈上升趨勢(shì)，花后5～10天，濟(jì)麥44的麥谷蛋白含量增速較快，花后10～35天增速稍下降，但麥谷蛋白含量持續(xù)增長(zhǎng)。花后5～20天，濟(jì)麥229的麥谷蛋白含量增速較20～35天的增速低。總體來(lái)看，整個(gè)籽粒發(fā)育時(shí)期，強(qiáng)筋小麥濟(jì)麥44和濟(jì)麥229的麥谷蛋白含量始終高于中筋小麥濟(jì)麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基組成類型看，5+10亞基組合的麥谷蛋白含量在整個(gè)籽粒灌漿期均高于4+12亞基組合。

2.3強(qiáng)筋小麥籽粒GMP的積累動(dòng)態(tài)

對(duì)3個(gè)小麥品種GMP含量進(jìn)行分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，籽粒發(fā)育過(guò)程中強(qiáng)筋小麥的籽粒GMP含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，中筋小麥呈“下降一上升一下降一上升”趨勢(shì)。具體看，花后5～15天濟(jì)麥44籽粒GMP含量增速較快，花后15～25天增速緩慢，花后25～35天增速上升。濟(jì)麥229籽粒GMP含量的增加趨勢(shì)與濟(jì)麥44相似，但其第二次高速增加期出現(xiàn)在花后30～35天。與強(qiáng)筋小麥不同的是，濟(jì)麥22在小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中，GMP含量出現(xiàn)兩次持續(xù)下降期，分別為花后5～15天和花后25～30天，兩次持續(xù)上升期在花后15～25天和花后30～35天。總體來(lái)看，在整個(gè)籽粒發(fā)育期間，強(qiáng)筋小麥濟(jì)麥44、濟(jì)麥229的GMP含量持續(xù)增加且高于濟(jì)麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基類型上看，5+10亞基組合的GMP含量在整個(gè)籽粒灌漿期持續(xù)增加，且灌漿中后期的含量均高于4+12亞基組合。

2.4強(qiáng)筋小麥成熟籽粒中的貯藏蛋白種類及相對(duì)含量分析

由結(jié)果（表1）可以看出，3個(gè)小麥品種共檢測(cè)到53個(gè)貯藏蛋白，分為三類，包括醇溶蛋白27個(gè)、Avenin-like蛋白16個(gè)和麥谷蛋白10個(gè)。3個(gè)小麥品種的貯藏蛋白相對(duì)含量不盡相同。53個(gè)貯藏蛋白中有18個(gè)在濟(jì)麥229中的相對(duì)含量高于濟(jì)麥22，其中醇溶蛋白P18573和P04726在濟(jì)麥229中的相對(duì)含量是濟(jì)麥22的3.58倍和4.21倍，Avenin-like蛋白AOA34IY3HO和A7XUQ5在濟(jì)麥229中的相對(duì)含量是濟(jì)麥22的9.21倍和3.18倍，麥谷蛋白P10387在濟(jì)麥229中的相對(duì)含量是濟(jì)麥22的3.87倍。53個(gè)貯藏蛋白中有33個(gè)在濟(jì)麥44中的相對(duì)含量高于濟(jì)麥22，其中Avenin-like蛋白A7XUQ5在濟(jì)麥44中的相對(duì)含量是濟(jì)麥22的3.79倍，麥谷蛋白P10387在濟(jì)麥44中的相對(duì)含量是濟(jì)麥22的4.07倍。

3討論與結(jié)論

小麥?zhǔn)称菲焚|(zhì)受籽粒蛋白與面筋蛋白含量的顯著影響。籽粒貯藏蛋白在灌漿過(guò)程中逐漸積累，其積累動(dòng)態(tài)表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。本研究顯示，籽粒醇溶蛋白含量和麥谷蛋白含量在籽粒灌漿期持續(xù)上升，這與前人研究結(jié)果相同。張容研究指出，5+10與2+12亞基組合的品質(zhì)差異來(lái)源從蛋白質(zhì)組分形成上看，主要是醇溶蛋白和麥谷蛋白后期的快速積累不同。本研究發(fā)現(xiàn)，濟(jì)麥44和濟(jì)麥229（5+10）的醇溶蛋白和麥谷蛋白均在花后20天之后較濟(jì)麥22（4+12）快。這與張容的研究結(jié)果相似。

谷蛋白大聚合體（GMP）是麥谷蛋白的重要組成部分，是衡量小麥加工品質(zhì)的指標(biāo)之一。鄧志英等發(fā)現(xiàn)，不同筋型小麥的GMP積累動(dòng)態(tài)存在顯著差異，強(qiáng)筋小麥花后10天便處于較高水平，成熟時(shí)GMP含量高于其它筋型小麥。本研究發(fā)現(xiàn)，籽粒灌漿過(guò)程中，強(qiáng)筋小麥GMP含量整體呈上升趨勢(shì)，花后5～25天累積較慢，之后快速增多，花后35天含量達(dá)到最高；而濟(jì)麥22籽粒GMP積累呈現(xiàn)“下降一上升一下降一上升”的趨勢(shì)，即花后5～15天含量逐漸降低，之后逐漸增加，花后25天又降低，花后30天始又增加。總體而言，籽粒灌漿期濟(jì)麥22的GMP含量低于2個(gè)強(qiáng)筋小麥品種。這與前人的研究結(jié)果相同，說(shuō)明籽粒灌漿中后期是強(qiáng)筋小麥與濟(jì)麥22小麥GMP含量產(chǎn)生差異的關(guān)鍵時(shí)期。

鄧志英等指出，不同亞基對(duì)GMP的積累有不同影響，含5+10亞基對(duì)的品種成熟期GMP含量增幅比前期有很大提高。張容指出，5+10亞基組合的小麥品種籽粒灌漿前期GMP占籽粒蛋白質(zhì)的比例較低，20天后一直維持在較高水平至成熟，說(shuō)明其GMP主要是在籽粒灌漿中后期形成。本研究發(fā)現(xiàn)，5+10亞基組合的小麥GMP含量在整個(gè)籽粒灌漿期保持增加趨勢(shì)，但濟(jì)麥44在花后25天開(kāi)始增速加大，而濟(jì)麥229在花后30天增速加大。說(shuō)明含有5+10亞基組合的小麥品種之間其GMP積累動(dòng)態(tài)也存在少許差異。

利用TMT技術(shù)從3個(gè)小麥品種成熟籽粒中共檢測(cè)到53個(gè)貯藏蛋白，有33個(gè)在濟(jì)麥44中的相對(duì)含量高于濟(jì)麥22，有18個(gè)在濟(jì)麥229中的相對(duì)含量高于濟(jì)麥22。分析濟(jì)麥44比濟(jì)麥22含量高的貯藏蛋白發(fā)現(xiàn)，其倍數(shù)介于1.01～4.07之間，倍數(shù)超過(guò)2的有2個(gè)。濟(jì)麥229比濟(jì)麥22含量高的貯藏蛋白倍數(shù)介于1.02～9.21之間，有5個(gè)倍數(shù)超過(guò)2，且AOA34IY3HO的倍數(shù)達(dá)到9.21倍。對(duì)TMT數(shù)據(jù)和麥谷蛋白、醇溶蛋白、GMP在3個(gè)小麥成熟籽粒中的含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，濟(jì)麥44較濟(jì)麥22貯藏蛋白含量高的原因是其大多數(shù)的貯藏蛋白表達(dá)量高，而濟(jì)麥229高蛋白含量的原因是部分貯藏蛋白超高量表達(dá)。