星油藤根腐病鐮孢屬病原真菌的鑒定及其拮抗菌篩選

劉陽平 張晉媛 林瑞 阮東碩 王偉偉

關鍵詞：星油藤；根腐病；鐮孢菌屬；芽孢桿菌；木霉菌

星油藤（PLukenetia VOILLbilis L．）學名南美油藤，屬大戟科多年生常綠攀援性藤本植物，其種子含油量高達45%～60%，且富含多不飽和脂肪酸，以及抗氧化劑VA、VE和蛋白質(zhì)等，具有較強的抗氧化性和藥食保健功能，對調(diào)整人體血脂、預防心血管疾病、防衰老等作用明顯，被譽為“植物腦黃金”。在我國，星油藤已被列人中國科學院支撐服務國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)化項目，目前僅在云南西雙版納、海南等少數(shù)地區(qū)種植。近年來星油藤根腐病發(fā)生嚴重，種植3年以上的植株發(fā)病率超過50%，癥狀表現(xiàn)為根和莖基部逐漸腐爛并蔓延至全株，導致植株生長遲緩、葉片變黃、枝條枯萎，最后全株死亡。

引起植物根腐病的病原種類較多。繆作清等對三七根腐病病原進行調(diào)查和鑒定，發(fā)現(xiàn)真菌類群主要包括壞損柱孢菌（Cylindrocarpon de-structans）、三七黃腐病菌（C．didynum）、茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）、尖鐮孢菌（F．oxysporum）、草莖點霉（Phoma herbarum）、立枯絲核菌（Rhizocto-nia solani）等。張德珍等報道引起山東省小麥根腐病的病原菌有麥根腐平臍蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）、尖鐮孢菌、層出鐮孢菌（F．prolifera-tum）、黃色鐮孢菌（F．culmorurn）等。嚴重威脅油梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根腐病病原為樟疫霉菌（Phytoph-thora cinnamomi Rands）。目前，西雙版納星油藤種植區(qū)報道的根腐病病原為尖鐮孢菌，海南省陵水縣報道茄腐鐮孢菌可引起星油藤根腐病。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海南大學儋州校區(qū)星油藤種植園中根腐病亦主要由鐮孢屬病原真菌侵染引起，但具體種尚未見報道。

根部病害所造成的危害往往是毀滅性的，發(fā)病初期不易被發(fā)現(xiàn)，化學農(nóng)藥的施用效果不理想，并且選擇性差，大量使用會嚴重降低土壤中有益菌群的數(shù)量，所以生物防治是植物根部病害防治的有效手段。本研究對海南大學儋州校區(qū)農(nóng)科基地星油藤根腐病鐮孢屬病原真菌進行分離，并依據(jù)柯赫氏法則及分子生物學進行鑒定：同時篩選并鑒定具有潛在開發(fā)前景的拮抗菌株，為星油藤根腐病的生物防治提供技術支撐。

1材料與方法

1.1病原物分離與純化

于海南大學儋州校區(qū)農(nóng)科基地采集星油藤根腐病發(fā)病病根，病根用自來水沖洗后用吸水紙吸干水分，剪成長為為5mm左右小段，用2%Na-C10消毒2min，轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基中置于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待長出菌落，挑取疑似鐮孢菌分離物，進行純化培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)物。觀察分離物菌落形態(tài)，并記錄、拍照。

1.2致病性鑒定

將滅菌土分裝在花盆（底部直徑10cm，高約12cm）中，每個花盆種植兩株星油藤，放置于28℃、RH為60%～80%的溫室中培養(yǎng)，并根據(jù)花盆中水分情況及時澆水，待星油藤長至5～6葉時，選取長勢較好的幼苗從土壤中取出，并沖洗，用消毒手術刀在幼苗莖基部劃一小傷口，然后用滅菌打孔器在培養(yǎng)7d的分離物菌落邊緣取直徑為5mm菌塊接種在傷口處，將接種幼苗放置在鋪有被無菌水浸濕的吸水紙的搪瓷盤中，用保鮮膜封住保濕。每株分離物接種10株星油藤幼苗，以不接菌為對照。每天觀察發(fā)病情況并記錄。待發(fā)病后，對發(fā)病部位病原菌進行分離，并鑒定是否與接種菌株一致。

1.3TEF序列擴增及測序

將分離物接種于PDA培養(yǎng)基上，放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后收集菌絲，并利用TIAN-GEN植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，提取方法參照試劑盒說明書。利用引物EFl/EF2，以不同分離物基因組DNA為模板，擴增TEF序列．PCR反應體系及程序參照文獻。擴增產(chǎn)物使用Diamond DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒進行純化回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將TEF序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，確定分離物分類地位。基于TEF基因，以Nectriaceaesp.JF740829和Nectriaceaesp.JF740791為外群，使用MEGA X構(gòu)建NJ樹（neighbor-joining tree），利用自展分析（bootstrap，1000次重復）檢驗各分支的置信度。

1.5拮抗細菌的篩選及鑒定

于健康星油藤植株根部取根際土，稱取10g加入90mL無菌水中混勻制成土壤懸浮液，利用梯度稀釋法分離拮抗細菌，并通過平板對峙試驗進行初篩。挑選具有拮抗效果的單菌落，以十字交叉法接種在距離培養(yǎng)皿1cm處，將致病真菌菌餅（5mm）接種在PDA培養(yǎng)基的正中間，置于28℃培養(yǎng)，以不接種拮抗菌為對照，每處理3個重復。待對照菌落長滿培養(yǎng)皿后以十字交叉法測量菌落直徑，計算拮抗菌株的抑制率。抑制率（%）=（對照組菌落直徑一試驗組菌落直徑）／對照組菌落直徑×1000

選取抑制率大于60%的拮抗細菌提取基因組DNA，以27F/1492R為引物分別擴增16SrD-NA序列，使用Diamond DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒進行純化回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將序列輸入Gene-Bank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，確定拮抗細菌的分類地位。

1.6拮抗木霉菌的篩選

為了篩選對星油藤根腐病具有較好拮抗效果的木霉菌株，選擇1 8株木霉菌（由海南大學植物保護學院劉銅教授惠贈），分別為棘孢木霉（Tri-choderma asperellum）

（HN059、XJ087、G2070、SC012、SCI01、SC098、XJ035、NX043），猥木霉（Zennaceum） LS019-2，哈茨木霉FJ069．綠色木霉，長枝木霉以及木霉菌HN083110-2、NX036、LG004-52、ZJB3-13、LS073 -23、LG027-32（未鑒定種），分別與星油藤根腐病菌DZG-43和DZG-13進行對峙培養(yǎng)，篩選抑制率較高的木霉菌，并驗證非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制效果，對木霉菌拮抗機理進行初步研究。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

使用軟件IBM SPSS Statistics 21（IBM Corp，Armonk，NY，USA）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，在P<0.05水平進行t檢驗。所有試驗至少重復3次。

2結(jié)果與分析

2.1病原茵分離

在海南大學儋州校區(qū)農(nóng)科基地星油藤種植園中星油藤根腐病發(fā)生嚴重，表現(xiàn)為根和莖基部逐漸腐爛，導致植株生長遲緩、葉片變黃、枝條枯萎，甚至全株死亡。采集根腐病病樣，經(jīng)分離純化共獲得5株分離物，分別命名為DZG-13、DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43。在PDA培養(yǎng)基上，分離物菌落顏色起初呈白色，之后氣生菌絲呈白色至淺粉色，基內(nèi)菌絲呈白色至黃色（圖1）。

2.2致病性測定

通過室內(nèi)接種試驗，菌株DZG-13、DZG-12、DZG-43表現(xiàn)出較強的致病力，接種7d后接種部位出現(xiàn)褐色壞死病斑，并向上、向下擴展，最終導致根部腐爛，地上部死亡。菌株DZG-1和DZG-16致病力較弱，接種部位出現(xiàn)褐色病斑，但不擴展。對照未發(fā)病，但在根部從土壤中取出過程中導致了不可避免的損傷（圖2）。在病部可重新分離獲得與接種菌株相同的分離物。

2.3病原菌鑒定

將TEF基因序列提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，菌株DZG-13、DZG-43、DZG-12、DZG-1和DZG-16的登錄號分別為MW115935～MW115939。經(jīng)Blast比對，DZG-13與Fusarium oxysporumKY859253和F．oxysporum MT313909相似度分別為99.05%和98.89%：DZG-16和DZG-43與F．solani MG857207和F．solani MG857198相似度均為100%; DZG-1和DZG-12與F．solanzMG857207和F．solani MG857198相似度分別為97.94%和95.43%。由圖3可以看出，DZG-13與F．oxysporum AF008504聚類；DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43與F．solani聚類，且DZG-16和DZG-43親緣關系更近。結(jié)合菌落形態(tài)特征，DZG-13鑒定為尖鐮孢菌（F．oxysporurn），DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43鑒定為茄腐鐮孢菌（F．solani）。

2.4拮抗細菌篩選與鑒定

拮抗細菌JK-A對鐮孢屬病原DZG-13、DZG-12和DZG-43的抑制率分別為68.19%、68.30%和69.70%，拮抗細菌JK-Z的抑制率分別為69.67%、68.67070和68.44%（圖4）。將擴增獲得的拮抗細菌16S rDNA序列分別在GeneBank數(shù)據(jù)庫中比對，JK-A與Bacillus cereus序列相似性為99.72%，JK-Z與B．subtilis相似性為99.93%。初步鑒定拮抗菌株JK-A為蠟樣芽孢桿菌（B．ce-reus），菌株JK-Z為枯草芽孢桿菌（B．subtilis）。

2.5拮抗木霉菌篩選

木霉菌株HN083110-2、LG004-52、NX043、ZJB3-13和綠色木霉對星油藤根腐病菌DZG-43具有較高的抑制率，分別為69.26%、67.68%、67.14%、66.35%和65.34%，顯著高于其它菌株（圖5A）；LG004-52、FJ069、XJ087、SC101、G2070、ZJB3-13和NX036對星油藤根腐病菌DZG-13具有較高的抑制率，分別為73.36%、73.30%、71.80%、71.75%、70.97%、70.26%和70.01%，顯著高于它菌株（圖SB）。選取HN083110-2、LG004-52、NX043、ZJB3-13和LG004-52、FJ069、XJ087、SC101分別驗證非揮發(fā)代謝物對DZG-43和DZG-13的抑制效果，結(jié)果表明．HN083110-2的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對DZG-43抑制效果最佳，抑制率為52.94%（圖5C）；FJ069的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對DZG-13的抑制效果最佳，抑制率為51.97%（圖5D）。其中，LG004-52的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對兩株病原菌均表現(xiàn)出較好的抑制效果。

3討論與結(jié)論

鐮孢屬真菌是引起植物根腐病的重要病原之一。由于鐮孢屬真菌的多型性和易變異的特點，使該屬真菌被認為是所有真菌類群中在形態(tài)分類上最難鑒定的屬之一。翻譯延伸因子TEF（translation elongation factor l-a）為鐮孢屬種水平上的系統(tǒng)發(fā)育提供了非常有用的信息。王琳等利用ITS、TEF和TUB基因?qū)ι轿魇＄犳呔N群分布及變異進行研究，發(fā)現(xiàn)TEF基因最適用于鐮孢菌種類鑒定。

本研究依據(jù)柯赫氏法則及基于TEF基因的系統(tǒng)進化分析，確定鐮孢屬真菌的兩個種F．oxys-porum和F．solani都可侵染星油藤根部引起根腐病。分離獲得的5株鐮孢屬病原菌中有4株為F．soLani，說明F．soLani為引起星油藤根腐病的主要致病菌。此外，4株F．solani菌株菌落形態(tài)以及致病性存在一定差異，證明F．solani存在一定遺傳多樣性，后續(xù)可通過大量采樣，對海南島星油藤根腐病鐮孢屬病原真菌遺傳多樣性進行研究。

本研究篩選獲得兩株拮抗菌株JK-A和JK-Z，通過擴增16S rDNA序列并比對，拮抗菌株JK-A為蠟樣芽孢桿菌（B．cereus），菌株JK-Z為枯草芽孢桿菌（B．subtilis）。芽孢桿菌JK-A和JK-Z對具有較強致病力的鐮孢屬病原菌DZG - 13、DZG-12和DZG-43的致病力均接近70%，可以考慮作為生防菌株進行開發(fā)。

木霉菌是一種應用較為廣泛的生防真菌，對多種植物病害具有較好的防治效果。本研究通過對峙培養(yǎng)篩選對星油藤根腐病菌（DZG-43和DZG-13）具有較好防治效果的木霉菌，研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對尖鐮孢菌（F．oxysporum）DZG-13的抑制率可以達到70%以上，優(yōu)于對茄腐鐮孢菌（F．solani）DZG-43的拮抗效果；其中木霉菌株LG004-52和ZJB3-13對兩株病原菌均表現(xiàn)出良好的拮抗效果。木霉菌拮抗病原菌的機制主要包括競爭、寄生以及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等，本研究對幾株拮抗效果較好的木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌效果進行了初步探究，發(fā)現(xiàn)HN083110-2的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對DZG-43抑制效果最佳，抑制率為52.94%：FJ069的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對DZG-13的抑制效果最佳，抑制率為51.97%。其中，LG004-52的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物對兩株病原菌均表現(xiàn)較好的抑制效果，下一步可對其非揮發(fā)代謝產(chǎn)物進行研究，篩選發(fā)揮主要功能的代謝物質(zhì)，有望開發(fā)為防治星油藤根腐病的生物農(nóng)藥。