基于網絡藥理-分子對接探討烏藥治療酒精性肝炎的作用機制

譚明明 張優妮 嚴聰聰 龐霄君 王軍偉

浙江省天臺縣人民醫院，浙江天臺 317200

烏藥（Lindera aggregata）系樟科山胡椒屬植物，有行氣止痛、溫腎散寒之功，成分包括揮發油、倍半萜類化合物、異喹啉類生物堿、黃酮類、木脂素以及環戊二烯酮等[1]。研究表明，烏藥可降低酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）模型大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶，緩解AH[2]。烏藥可通過調節大鼠腸道菌群，抑制炎癥反應，發揮保肝效應，機制與降低TLR4/NF-κB 通路的激活有關[3]。本研究基于網絡藥理學，篩選烏藥的活性成分和潛在靶點，分析關鍵蛋白涉及的生物學功能及信號通路，構建“活性分子-靶點-通路”的網絡藥理圖。通過分子對接技術，分析烏藥活性成分與靶蛋白的相互作用，為進一步揭示烏藥治療AH 的藥理機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 烏藥組分

通 過TCMSP[4]以“烏 藥”為 檢 索 詞，獲 得烏藥所有成分信息，設定篩選參數OB ≥30%、DL ≥0.1[5]。

1.2 活性成分靶蛋白預測

采用三種在線工具預測活性分子的靶蛋白，分別是：利用TCMSP 預測活性分子的靶蛋白，基于Uniprot[6]對蛋白名稱進行Symbol 轉化，利用BATMAN[7]預測活性分子對應的靶蛋白，并根據靶蛋白相互作用與已知靶點相似的可能性進行得分排序，設定Score cutoff=20。利用在線工具Swiss target prediction[8]，預測化合物的靶標，設定篩選物種為“Homo sapiens”“Probability＞0”。將所有篩選到的活性成分靶蛋白進行合并作為潛在靶蛋白。

1.3 篩選疾病相關靶蛋白

以“Hepatitis，Alcoholic”為關鍵詞，分別在CTD[9]、DisGeNET[10]及GeneCards[11]中，檢索AH 相關基因。整合三個數據庫的檢索結果，并與先前預測的靶蛋白取交集，認定AH 相關的靶蛋白。

1.4 功能和通路富集分析

利用R 軟件包clusterProfiler[12]對AH 靶蛋白進行GO 生物過程和KEGG 通路富集分析，參數設置為FDR＜0.05，選取富集最顯著的前20 位功能條目或通路，繪制氣泡圖。

1.5 靶蛋白相互作用分析

利用在線數據庫String[13]對靶蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）進行分析，物種設置為“Homo sapiens”“combined score ≥0.4”。利用Cytoscape[14]對PPI 進行可視化。采用CytoNCA[15]對PPI 網絡中的節點進行中心度（degree centrality，DC）分析，參數設置為“without weight”。通過各個節點的連接度排名，得到PPI 網絡中的重要節點，即為hub 蛋白。利用Cytoscape 軟件的MCODE 插件識別網絡中的模塊基因，參數設置為“Degree Cutoff=2”“Node Score Cutoff=0.2”“K-core=2”“Max Depth=100”。

1.6 藥理學網絡構建

基于“烏藥- 成 分- 靶 蛋白- 通 路”，利 用cytoscape 構建藥理學網絡，展示烏藥活性成分的靶蛋白及信號通路。

1.7 分子對接

選取富集到AH 通路的基因，通過PDB 數據庫[16]下載靶蛋白結合配體復合物的PDB 格式文件，采用pymol 進行復合物的預處理，得到靶標蛋白，進行分子對接。設定靶蛋白的篩選條件：通過X 射線衍射方法獲得的蛋白質結構；蛋白 質 結 構 分 辨 率＜3；“Polymer Entity Type”設置為“Protein”；得分降序排名第一。選取藥理學網絡中連接度較大的成分作為關鍵分子，通過PubChem 數據庫[17]下載關鍵分子的分子結構，并保存為SDF 格式文件，通過pymol 轉換為PDB 格式，用于分子對接。將處理好的靶蛋白與活性分子導入Autodock[18]，采用Lamarckian GA 算法進行分子對接。

2 結果

2.1 烏藥活性成分

通過檢索TCMSP，得烏藥的127 種化學成分。按閾值篩選得到33 種重要成分（表1）。

2.2 活性成分的靶蛋白預測

根據設定的閾值，TCMSP 共預測得到371 個成分-靶標關系對，包含了30 個活性成分、177 個靶 標；BATMAN 共 預 測 得 到1095 個 成 分- 靶標關系對，包含了13 個活性成分、488 個靶標；Swiss target prediction 共預測得到1451 個成分-靶標關系對，包含了30 個活性成分、551 個靶標。合并以上的預測結果，共得到2838 個活性成分-靶蛋白關系對，包括33 個活性成分和1019 個靶蛋白。

基于三個數據庫（CTD、DisGeNET 和GeneCards）依次得到AH 相關基因9248、133、6115 個。對上述預測得到活性成分相關的靶基因和3 個疾病相關基因集取交集，篩選得到27 個重疊的靶蛋白，這些靶蛋白被認為是烏藥治療AH 中的潛在作用靶蛋白。

2.3 靶蛋白功能和通路富集分析

對上述27 個潛在靶基因進行GO 和KEGG 通路富集分析。GO 顯示，最顯著的前20 位基因功能涉及白細胞遷移、細胞黏附的正向調節、DNA 結合轉錄因子的調節、細胞對生物刺激的應答等（圖1A）。KEGG 分析結果顯示，富集最顯著的信號通路包括細胞衰老、Toll 樣受體通路、C 型凝集素受體通路、人T 細胞白血病病毒1 感染、乙型肝炎、TNF 信號通路等（圖1B）。

圖1 靶蛋白的功能通路富集top20 結果氣泡圖

2.4 靶蛋白相互作用分析

通過String 對靶蛋白的PPI 進行預測，采用Cytoscape 生成網絡圖。結果顯示，共有25 個蛋白有互作關系，161 個關系對（圖2A）。網絡圖中degree 值較高的前10 位蛋白，分別是TP53、TNF、IL-1B、IL-6、MYC、CXCL8、ICAM1、SIRT1、IL-10、SYK，即為潛在的靶蛋白。

圖2 活性成分-靶蛋白相互作用的PPI 網絡圖（A）及功能子模塊（B）

采用MCODE 算法，共篩選出2 個子模塊，module1 和module2，其中上述hub 蛋白均包含在模塊內（圖2B）。

2.5 “活性成分-靶點-通路”網絡構建

基于上述得到的27 個關鍵靶蛋白，結合其對應的成分，靶蛋白及通路關系，構建“活性成分-靶點-通路”網絡，如圖3 所示，網絡共包含59 個節點。其中PIK3CD、PIK3CA、PPARG、TNF、RELA、IL-6、IL-1B、TP53 等可能是烏藥作用AH 的潛在靶點；這些靶點富集到的通路有20 個，包括PI3K/AKT 信號通路、癌癥中心碳代謝、丙型肝炎、C 型凝集素受體信號通路、人T 細胞白血病病毒1 感染、Toll 樣受體信號通路等。

圖3 “活性成分-靶點-通路”網絡圖

2.6 分子對接

選取PPI 網絡中AH 相關的蛋白，共有6 個，為CXCL8、IL-1B、IL-6、TNF、SIRT1 和RELA，基于“活性成分-靶點-通路”網絡，篩選靶蛋白對應的活性分子。對于多個活性分子靶向同一個蛋白，選取連接度較大的作為關鍵節點，最終篩選到3 個活性分子，依次為槲皮素（quercetin），亞油酸（EIC）和石梓呋喃（gmelofuran）；其中quercetin 靶向CXCL8、IL-1B、IL-6、RELA 和TNF；EIC 靶向IL-1B、IL-6和TNF；gmelofuran 靶向SIRT1。結果表明，活性成分與關鍵靶點具有較強的結合活性，主要通過氫鍵相互作用與靶蛋白的氨基酸位點結合。

3 討論

本研究采用網絡藥理學研究，預測烏藥治療AH的關鍵靶點及作用機制。通過在線預測工具，共篩選得到27 個重要靶蛋白。功能和通路富集分析顯示，這些分子主要參與白細胞遷移、細胞黏附的正向調節、DNA 結合轉錄因子的調節、Toll 樣受體通路、C 型凝集素受體通路、乙型肝炎、TNF 信號通路等。分析顯示，烏藥的活性成分可通過多種信號通路干預AH，其中PIK3CD、PIK3CA、PPARG、TNF、RELA、IL-6、IL1B、TP53 是網絡中關鍵節點，可能是烏藥作用于AH 的潛在靶點，涉及的通路包括PI3K/AKT 信號通路，癌癥中心碳代謝，Toll 樣受體信號等。

本研究對烏藥治療AH 的主要活性成分，潛在靶點及作用機制進行探討，闡述了多組分、多靶點以及多種通路間相互作用的復雜網絡關系。通過構建“活性分子-靶點-通路”網絡，結合分子對接技術，預測烏藥中的三種活性成分，槲皮素、亞油酸和石梓呋喃可能通過氫鍵結合炎癥通路（CXCL8、IL1B、IL-6、RELA、TNF 和SIRT1）的多個關鍵蛋白，參與調控炎癥反應，從而發揮保肝作用。本研究獲得了對三種活性成分在AH 保護作用機制中靶點的概述，將為烏藥在治療AH 中的作用提供更好的研究視角和見解。