非編碼RNA對晝夜節(jié)律調(diào)控的研究進(jìn)展

李海朋 馮瑪莉

山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030000

DNA 中的遺傳信息通過RNA 被傳遞給蛋白質(zhì)，少數(shù)基因組被用于編碼蛋白質(zhì)，剩余不能編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本則被稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[1]。ncRNA 可分為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)型RNA和調(diào)控型RNA，本文探討的ncRNA 為調(diào)控型RNA。ncRNA 分為長鏈ncRNA（long ncRNA， lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等。它們參與生物個體的發(fā)育與分化、生殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞重編程[2]。

隨著人們的壓力越來越大，晝夜節(jié)律紊亂，導(dǎo)致與晝夜節(jié)律相關(guān)疾病，如心臟病、潰瘍等發(fā)病率也隨之上升。因此，深入了解晝夜節(jié)律運(yùn)行機(jī)制對于疾病預(yù)防和有效干預(yù)至關(guān)重要。本文將從晝夜節(jié)律、miRNA、lncRNA 及circRNA 四方面探討ncRNA 對晝夜節(jié)律的影響。

1 晝夜節(jié)律

晝夜節(jié)律是指光敏感生物協(xié)調(diào)自己的生理和行為，以適應(yīng)地球時(shí)間（24 h）的日常變化[3]。晝夜節(jié)律系統(tǒng)主要由兩部分組成：服務(wù)時(shí)鐘和客戶時(shí)鐘。服務(wù)時(shí)鐘位于下丘腦的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）上，客戶時(shí)鐘以互鎖轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)（translation feedback loop，TTFL）的形式嵌入幾乎每個細(xì)胞中。此外細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）作為蛋白質(zhì)和ncRNA 的重要細(xì)胞間載體，攜帶同步信號，并根據(jù)服務(wù)時(shí)鐘校正客戶時(shí)鐘[4]。

光刺激通過視網(wǎng)膜向下丘腦傳遞，SCN 直接響應(yīng)光刺激而重置其時(shí)鐘階段。哺乳動物的TTFL 為：蛋白腦和肌肉芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，Bmal1）和晝夜運(yùn)動輸出周期蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，clock）相互結(jié)合形成異源二聚體，復(fù)合物與周期蛋白（period homolog，per）、促進(jìn)隱花色素（cryptochrome homolog，cry）中的E-box 調(diào)節(jié)元件結(jié)合。但per和cry 在表達(dá)成熟時(shí)，會形成新的蛋白復(fù)合物，抑制Bmal1 和clock 活動。當(dāng)per 和cry 的mRNA 水平下降時(shí)，per-cry 復(fù)合物降解，開始新的循環(huán)，形成生物鐘[5]。除核心回路外，還有兩個子回路，它們與核心回路協(xié)同完成振蕩。第一個由視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體（retinoic acid receptor-related orphan receptor，ROR）和孤兒核激素受體（reverseerythroblastosis，Rev-erb）組成。Rev-erb 和Ror 與Ror 結(jié)合元件（retinoic acid receptor-related orphan receptors elements，Rore）競爭性結(jié)合，Rev-erb 抑制Bmal1 和clock 的表達(dá)，而ROR 反而激活clock和Bmal1。第二個由D-box 相關(guān)蛋白組成，包括D-box 結(jié)合蛋白（D-box binding protein，DBP）、促甲狀腺激素胚胎因子（thyrotroph embryonic factor，TEF）和肝白血病因子（hepatic leukaemia factor，HLF）。這些蛋白質(zhì)和核因子與白細(xì)胞介素3 調(diào)節(jié)蛋白（nuclear factor interleukin-3-regulated protein，NFIL3）相互作用[4]。翻譯后進(jìn)行的磷酸化、乙酰化、糖基化和次酰化等修飾在TTFL 的動力學(xué)中同樣起著關(guān)鍵作用，尤其是per 和cry 的蛋白的磷酸化對于一個完整的生物鐘周期是不可或缺的[6]。TTFL的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄反饋循環(huán)通路存在于每個細(xì)胞中，在組織器官中也存在生物鐘調(diào)控模式。

2 miRNA對晝夜節(jié)律的影響

miRNA 是由約22 個核苷酸構(gòu)成的小ncRNA分子，可調(diào)控基因表達(dá)和作為多種基本細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，如細(xì)胞凋亡、分化、增殖等[7]。miRNA 參與晝夜節(jié)律調(diào)控況情見圖1。

圖1 哺乳動物的TTFL 構(gòu)成及miRNA 對TTFL 的影響

2.1 對SCN的影響

SCN 接收光信號后與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官進(jìn)行通信，將客戶時(shí)鐘與環(huán)境時(shí)間同步[8]。光誘導(dǎo)的miR-132 可減弱重置或夾帶時(shí)鐘的能力，它的直接靶標(biāo)是參與染色質(zhì)重塑和翻譯控制的基因，這些基因的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)是miR-132 依賴性調(diào)節(jié)per 基因表達(dá)和時(shí)鐘夾帶的基礎(chǔ)。并證明miR-132/212 的基因消融改變了夾帶的周期和SCN中per2 表達(dá)的光周期[9]。與腫瘤相關(guān)的miR-17-5p在小鼠的SCN 中有節(jié)奏地表達(dá)，它的增加和減少均會導(dǎo)致cry1 水平的增加和自由運(yùn)行期的縮短，miR-17-5p 通過與clock 相互作用，在檢查和穩(wěn)定生物鐘周期方面發(fā)揮重要作用[10]。

神經(jīng)內(nèi)分泌通路控制SCN 誘導(dǎo)的外周效應(yīng)，包括自主神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)末梢誘導(dǎo)腎上腺素/去甲腎上腺素的釋放、下丘腦-垂體-腎上腺軸誘導(dǎo)腎上腺釋放糖皮質(zhì)激素和激活松果體誘導(dǎo)褪黑激素釋放[11]。其中褪黑激素是調(diào)節(jié)日常和季節(jié)性節(jié)律的關(guān)鍵激素，有研究發(fā)現(xiàn)miR-7 在豬松果體細(xì)胞中特異性表達(dá)并調(diào)節(jié)褪黑激素的合成[12]。

2.2 對TTFL的影響

對TTFL 的調(diào)控表現(xiàn)在對核心基因和核心鐘基因轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾的影響。miRNA 對轉(zhuǎn)錄翻譯的影響如上文所示：miR-132 的直接靶標(biāo)是參與染色質(zhì)重塑和翻譯控制的基因，從而影響晝夜節(jié)律。miRNA 對核心鐘基因調(diào)控的機(jī)制為與其3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，抑制它們的翻譯并增強(qiáng)mRNA 的降解。例如miR-455-5p 與clock的3’-UTR 結(jié)合并調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性[13]；同樣熒光素酶報(bào)告顯示miR-27b-3p 以劑量依賴性方式抑制Bmal1 的3’-UTR 活性，降低了Bmal1 的蛋白表達(dá)水平并損害了內(nèi)源性Bmal1[14]。miRNA 對核心鐘基因的影響，在不同的組織會產(chǎn)生不同的生物節(jié)律，比如代謝、進(jìn)食、先天免疫和休息運(yùn)動等生物節(jié)律。

2.2.1 代謝節(jié)律 肝臟的晝夜節(jié)律在維持代謝穩(wěn)態(tài)中起重要作用。miR-10a 調(diào)節(jié)各種肝臟代謝基因，直接抑制RORA 的表達(dá)，下調(diào)Bmal1 的表達(dá)，同時(shí)抑制了脂質(zhì)合成基因、脂肪酸合酶、糖異生、蛋白質(zhì)合成和膽汁酸合成，這些導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂和肝損傷[15]。同樣miR-181a 增加了脂肪的產(chǎn)生，在永生化骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞以及原發(fā)性患者脂肪來源的基質(zhì)細(xì)胞脂肪生成過程中發(fā)現(xiàn)，miR-181a 通過靶向per3 產(chǎn)生了脂肪[16]。

2.2.2 進(jìn)食節(jié)律 當(dāng)進(jìn)食規(guī)律改變時(shí)，生物鐘基因會相應(yīng)的改變。白天進(jìn)食時(shí)改變了per1 的峰值，并且在切除80%小腸的小鼠發(fā)現(xiàn)miR-125a 的含量增加[17]。在研究前額葉皮層中的外圍晝夜節(jié)律振蕩器參與食物獎勵誘導(dǎo)活動的機(jī)制實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p 在大鼠的前額葉皮層誘導(dǎo)節(jié)律時(shí)鐘基因表達(dá)，尤其是per2 和clock，改變大鼠的進(jìn)食規(guī)律[18]。

2.2.3 免疫 晝夜節(jié)律紊亂會增加肝細(xì)胞癌、肺癌和結(jié)腸直腸癌等癌癥發(fā)生的概率。per1 通過在細(xì)胞周期、生長和凋亡過程抑制細(xì)胞生長，miR-34a將per1 作為靶標(biāo)可控制細(xì)胞生長和死亡平衡并降低腫瘤的生長[19]。Bmal1 誘導(dǎo)miR-103 的表達(dá)，對大鼠腦動脈鈣通道的晝夜節(jié)律進(jìn)行調(diào)節(jié)，改變大鼠腦血管收縮力，從而增強(qiáng)大鼠的免疫力[20]。

2.2.4 睡眠節(jié)律 強(qiáng)烈的壓力和記憶會改變動物的快速眼動睡眠，所以在休克的動物發(fā)現(xiàn)其基底外側(cè)杏仁核的miRNA 表達(dá)改變和快速眼動睡眠減少。將miR-221 顯微注射到中基底外側(cè)杏仁核中，減弱了快速眼動睡眠的減少[21]。將小鼠植入生物遙測單元，連續(xù)記錄腦電圖/肌電圖生物電位3 d。發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比，miR-155 敲除小鼠的非快速眼球運(yùn)動、快速眼球運(yùn)動睡眠次數(shù)和腦電波慢波反應(yīng)均降低[22]。

2.3 對EV的影響

EV 是一組異質(zhì)的細(xì)胞衍生的膜結(jié)構(gòu)，包括外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體和微泡存在于生物體液中，參與多種生理和病理過程。EV 現(xiàn)在被認(rèn)為是細(xì)胞間通信的額外機(jī)制，允許細(xì)胞交換蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)[23]。

最近發(fā)現(xiàn)EV 會影響晝夜節(jié)律系統(tǒng)。首先EV調(diào)節(jié)促使per 乙酰化的沉默調(diào)節(jié)蛋白1[24]、調(diào)節(jié)cry和Bmal1/clock[25]。小鼠血清中的miR-494、miR-152和miR-494 在介導(dǎo)外周晝夜節(jié)律振蕩器節(jié)律性中發(fā)揮作用，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)這3 種miRNA 在微泡中富集。并且miR-142-3p 通過囊泡運(yùn)輸在細(xì)胞之間進(jìn)行交流，當(dāng)抑制囊泡運(yùn)輸時(shí)，整體時(shí)鐘基因節(jié)律會被改變[11]。

3 lncRNA對晝夜節(jié)律的調(diào)控

lncRNA 是一類長度至少為200 個核苷酸的線性RNA 轉(zhuǎn)錄本，雖然lncRNA 的數(shù)量遠(yuǎn)大于miRNA，但其調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制尚不完全清楚。與miRNA 類似，lncRNA 在視網(wǎng)膜、肝臟和松果體中呈晝夜節(jié)律性或差異性表達(dá)。在對恒定黑暗和恒定光照條件下，斑馬魚幼蟲下分別有269 和309 個lncRNAs 顯示晝夜節(jié)律[26]。

lncRNA 可以靶向鐘基因影響晝夜節(jié)律。結(jié)腸炎相關(guān)的lncRNA（Lnc-UC）可通過組蛋白3降低自身基因沉默活性，增強(qiáng)Rev-erb 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Lnc-UC的循環(huán)表達(dá)由Bmal1 通過E-box 元件產(chǎn)生，這些將生物鐘與結(jié)腸炎聯(lián)系起來。并且發(fā)現(xiàn)Lnc-UC 敲除的小鼠晝夜節(jié)律紊亂和對結(jié)腸炎敏感[27]。用非酒精性脂肪性肝病嚙齒動物模型進(jìn)行l(wèi)ncRNA 微陣列，發(fā)現(xiàn)lncRNA，例如FLRL1、FLRL6 和FLRL2 參與了晝夜節(jié)律，其中干擾FLRL2 表達(dá)會影響B(tài)mal1的表達(dá)，此外FLRL2 還參與Bmal1 介導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制[28]。TCONS_00044595 在松果體中高度富集，并具有節(jié)律性。它受抑制時(shí)可以減輕糖氧剝奪條件下培養(yǎng)的松果體細(xì)胞和缺氧缺血性腦損傷后松果體體內(nèi)的clock 激活。miR-182 可以調(diào)節(jié)松果體時(shí)鐘表達(dá)，并靶向TCONS_00044595和clock 影響晝夜節(jié)律[29]。

4 其他ncRNA

circRNA 是一組具有共價(jià)閉合連續(xù)環(huán)的ncRNA，可作為miRNA 海綿，包含數(shù)個與一個或多個不同的miRNA 互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控中發(fā)揮作用[30]。現(xiàn)也發(fā)現(xiàn)部分circRNA 可調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。首先circRNA 具有晝夜節(jié)律性，將松果體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析后獲得了40 個差異表達(dá)的circRNA，其中20 個circRNA 在白天顯著上調(diào)，20 個circRNA 在夜間顯著上調(diào)[31]。CircR-WNK2 存在于大鼠的松果體、視網(wǎng)膜和腦中，并且在松果體和視網(wǎng)膜中高表達(dá)。通過競爭性內(nèi)源性RNA 機(jī)制參與調(diào)節(jié)褪黑激素的分泌。當(dāng)circR-WNK2 敲低時(shí)，miR-328a-3p 表達(dá)上調(diào)并抑制芳香胺-N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶mRNA 表達(dá)。現(xiàn)其他ncRNA 對晝夜節(jié)律的調(diào)控尚未發(fā)現(xiàn)。

5 小結(jié)

本文從服務(wù)時(shí)鐘、客戶時(shí)鐘和EV 三方面講述了miRNA 對晝夜節(jié)律的影響。miRNA 對SCN 調(diào)控主要通過miR-132 減弱重置或夾帶時(shí)鐘。光通過視網(wǎng)膜被傳遞到SCN，經(jīng)過處理和整合后，再通過激素和自主神經(jīng)系統(tǒng)將環(huán)境信息傳遞到外周組織的子時(shí)鐘中。不同的組織的晝夜節(jié)律主要依靠TTFL 來完成。miRNA 可以調(diào)控哺乳動物的代謝、進(jìn)食、先天免疫、和休息運(yùn)動節(jié)律等。EV 作為蛋白質(zhì)和ncRNA 的重要細(xì)胞間載體，EV 會攜帶ncRNA 影響晝夜節(jié)律。后續(xù)不僅要檢測EV 攜帶的其他晝夜節(jié)律相關(guān)分子，而且要驗(yàn)證這些分子的具體功能及miRNA 對其影響。

目前l(fā)ncRNA 調(diào)控晝夜節(jié)律的機(jī)制還不完全清楚，但有學(xué)者認(rèn)為lncRNA 的調(diào)節(jié)機(jī)制與miRNA的類似[32]。miRNA 的節(jié)奏表達(dá)通常由核心時(shí)鐘驅(qū)動，核心時(shí)鐘基因形成互鎖轉(zhuǎn)錄反饋回路。這些轉(zhuǎn)錄因子也被證明可以調(diào)節(jié)lncRNA 的節(jié)律表達(dá)。lncRNA 調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的機(jī)制是否與miRNA 一致需要進(jìn)一步探討。其他ncRNA 對晝夜節(jié)律的影響的研究較少，后續(xù)也可進(jìn)一步研究其他ncRNA 對晝夜節(jié)律的調(diào)控。