基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的梔子豉湯治療2型糖尿病的作用機(jī)制研究

張科楠 張淑玲 劉文文 常文武 何俊玲 汪亞婭 王錦超 袁倩文

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)孫思邈醫(yī)院藥學(xué)部，陜西銅川 727100；2.銅川市中醫(yī)醫(yī)院針灸推拿科，陜西銅川 727100；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)孫思邈醫(yī)院急診科，陜西銅川 727100

2 型糖尿病（type 2 diabeties mellitus，T2DM）是以胰島素抵抗或胰島β 細(xì)胞功能分泌障礙為主的代謝性疾病[1]。其已成為與腫瘤、心血管疾病并列的發(fā)病率和病死率最高的三大非傳染性疾病之一。目前西藥以口服二甲雙胍、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類等藥物治療為主，增加組織對(duì)葡萄糖的利用、減緩吸收、增加胰島素的敏感性[2]，但長(zhǎng)期應(yīng)用易引起胃腸不適、肝臟毒性及耐藥性等。

梔子豉湯源于《傷寒論》，由梔子和淡豆豉組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示梔子、淡豆豉均有降血糖、改善糖耐受的作用[3-4]。該方治療T2DM 的文獻(xiàn)已有報(bào)道[5]。但目前仍以單味藥為主，缺乏系統(tǒng)地探討該方作用機(jī)制的研究，因此本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究梔子豉湯中活性成分對(duì)T2DM 的改善機(jī)制，為該方臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 梔子豉湯活性成分及靶點(diǎn)的收集

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集梔子豉湯活性成分，查閱文獻(xiàn)[6-7]對(duì)相關(guān)成分進(jìn)行補(bǔ)充，活性成分在Chembiodraw Ultra13.0 軟件中繪制出各自的結(jié)構(gòu)圖，以SDF 格式儲(chǔ)存。在PharmMapper 上傳SDF文件，獲得虛擬篩選結(jié)果。運(yùn)用uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將收集的靶點(diǎn)的蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2 T2DM靶點(diǎn)收集

利用GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Type 2 Diabeties Mellitus”為關(guān)鍵詞檢索T2DM 疾病靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

Venn 圖繪制活性成分靶點(diǎn)與T2DM 靶點(diǎn)的交集，將交集靶點(diǎn)在Cytoscape 3.7.2 軟件繪制“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分子對(duì)接

將PPI 中排名前10 位的靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接，利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得化合物結(jié)構(gòu)，通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用AutoDock 1.5.6 及Pymol 2.4 軟件進(jìn)行制圖。

1.6 通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

2 結(jié)果

2.1 梔子豉湯活性成分及靶點(diǎn)的收集

共收集到梔子豉湯中27個(gè)活性成分，梔子18個(gè)、淡豆豉9 個(gè)。活性成分的作用靶點(diǎn)為303 個(gè)。

2.2 梔子豉湯治療T2DM的潛在作用靶點(diǎn)

整合各數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的疾病靶點(diǎn)，去重后，共獲得942 個(gè)T2DM 的相關(guān)靶點(diǎn)，其與藥物有138 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 梔子豉湯治療T2DM 潛在作用靶點(diǎn)

2.3 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、大豆皂苷Ⅰ成分為治療T2DM 的主要活性成分。見(jiàn)圖2。

圖2 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有138 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1092 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為15.8。度值排名靠前的靶點(diǎn)為腫瘤壞死因子（TNF）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）等。見(jiàn)圖3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

2.5 分子對(duì)接

將PPI 中排名前10 位的靶點(diǎn)與及其對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表1，部分對(duì)接圖見(jiàn)圖4。

表1 梔子豉湯活性成分分子對(duì)接結(jié)果

圖4 活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接模式圖

2.6 GO及KEGG富集分析

GO 功能分析共涉及生物過(guò)程2546 項(xiàng)，細(xì)胞組成60 項(xiàng)，分子功能181 條，取前10 條展示結(jié)果見(jiàn)圖5。KEGG 共富集到175 條信號(hào)通路，取前20 條展示（圖6）。結(jié)果表明梔子豉湯治療T2DM 與糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE、IL-17、TNF 等通路有關(guān)。選取AGE-RAGE 信號(hào)通路展示見(jiàn)圖7。

圖5 GO 富集分析柱狀圖

圖6 KEGG 富集分析氣泡圖

圖7 糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)通路

3 討論

“消渴”最早見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，后世醫(yī)家在黃帝內(nèi)經(jīng)的基礎(chǔ)上認(rèn)識(shí)到消渴與臟腑氣血功能失調(diào)有關(guān)，陰虛燥熱是消渴的主要病機(jī)[8]，因此消渴以清熱潤(rùn)燥、養(yǎng)陰生津?yàn)橹饕蝿t。梔子豉湯中梔子為君藥，清內(nèi)熱，解消渴，通小便，解火郁，可引導(dǎo)心火下行；淡豆豉為臣藥，可宣熱滋陰，降利胃氣，兩藥配伍，一升一降，滋陰降火，活血化瘀，達(dá)到標(biāo)本兼治之功效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇為治療T2DM 的主要活性成分。槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平、增強(qiáng)胰島素敏感性、改善胰島素抵抗發(fā)揮治療T2DM 的作用[9-10]。同時(shí)可消除氧化應(yīng)激以降低T2DM 鐵死亡來(lái)實(shí)現(xiàn)胰島β 細(xì)胞正常功能[11]。山柰酚具有改善組織對(duì)胰島素的敏感性、顯著降低血糖、抑制胰島β 細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂的作用[12-13]。有研究顯示，β-谷甾醇可使腸道葡萄糖吸收減少、糖異生途徑及糖原分解減少，從而使血糖水平降低[14]。

PPI 結(jié)果顯示TNF、JUN、AKT1 等為梔子豉湯治療T2DM 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。有研究表明TNF-α 與胰島素抵抗和胰島β 細(xì)胞損傷直接相關(guān)[15]。TNF 直接作用于胰島β 細(xì)胞，產(chǎn)生NO，從而導(dǎo)致胰島素分泌不足[16]。JUN 的激活與胰島素抵抗和代償性胰島素分泌有關(guān)，T2DM 中血漿葡萄糖水平增高，有助于JUN 的活化。JUN 的激活也與糖尿病并發(fā)癥有關(guān)[17]。AKT1 作為胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它可作用于胰島素的生理代謝，AKT1 磷酸化可促進(jìn)糖原合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取、蛋白質(zhì)生物合成等[18]。AKT1 被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）激活后，通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)刺激胰島β 細(xì)胞分泌胰島素，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡。研究顯示，敲除小鼠AKT 基因后，表現(xiàn)為T2DM 表型[19]。

KEGG 通路顯示，梔子豉湯治療T2DM 主要涉及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE、IL-17 等信號(hào)通路等。AGE-RAGE 信號(hào)通路可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損和胰島素抵抗[20]。RAGE 可引起PI3K/AKT、核因子-κB（NF-κB）等細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活（如圖7 所示），PI3K/AKT 作為胰島素下游主要分子通路，具有調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)分子代謝，促進(jìn)肌肉和肝臟中糖原合成，維持血糖穩(wěn)態(tài)水平的作用[21]。NF-κB p65 決定炎癥因子釋放，當(dāng)NF-κB 被激活，大量炎癥因子增多，損傷胰島細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體糖代謝紊亂[22-23]。研究表明槲皮素可抑制AGEs 下調(diào)RAGE 的表達(dá)以延緩糖尿病的進(jìn)展[24]。IL-17 作為促炎細(xì)胞因子，參與炎癥信號(hào)通路激活。研究表明，IL-17 可激活NF-κB 信號(hào)通路，刺激促炎因子[IL-1、IL-6、TNF、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）]的釋放，共同抑制胰島素信號(hào)通路、誘導(dǎo)胰島素抵抗、從而導(dǎo)致T2DM 的發(fā)展[25]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)梔子豉湯的成分、靶點(diǎn)及治療T2DM 的途徑進(jìn)行探索性研究，結(jié)果顯示該方可通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路共同影響T2DM 的進(jìn)程，為梔子豉湯改善T2DM 的后續(xù)臨床研究提供一定的理論基礎(chǔ)。