大豆異黃酮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

徐建國(guó) 谷榮輝 李 曬 杜宏洋 李 麗 王博文 秦志文 陶泉坊 趙士弟

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院影像學(xué)院，安徽蚌埠 233030；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院心腦血管基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蚌埠 233030；4.蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030

腦缺血性損傷主要是因?yàn)楣┙o腦部的血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化從而導(dǎo)致的腦供血不足現(xiàn)象，臨床上缺血性腦卒中占腦血管病的80% 左右[1-3]。對(duì)于腦缺血性疾病的治療手段一方面是采取溶栓治療，另一方面是使用抗凝藥物等改善腦血管循環(huán)障礙。但由于對(duì)于治療時(shí)間的要求，絕大多數(shù)患者救治時(shí)間窗短暫。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是建立在腦缺血性損傷的基礎(chǔ)上，由于堵塞的血管血流重新供應(yīng)，氧自由基生成過多并發(fā)生累積，從而進(jìn)一步加重腦組織損傷。Ca2+超載是由于組織或細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生異常的現(xiàn)象，是引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡最主要的因素[4]。腦CIRI 病理過程中Ca2+超載和氧自由基損傷起到重要作用，現(xiàn)有研究表明，大豆異黃酮（soy isoflavones，SI）可降低Ca2+濃度和氧自由基，進(jìn)而減輕大鼠腦組織由于氧化應(yīng)激造成的損傷[5-8]。本研究通過建立大鼠腦CIRI 模型，觀測(cè)大鼠腦組織氧化應(yīng)激和Ca2+超載損傷，探究大豆異黃酮對(duì)大鼠CIRI 后的保護(hù)作用及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠，200 ～300 g，由濟(jì)南鵬悅公司提供[許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003]，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（倫審編號(hào)：2022-209），SI 由Acmec 公司提供，純度為40%。

1.2 儀器與試劑

采用Servicebio 公司生產(chǎn)多功能酶標(biāo)儀。2，3，5- 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染液由Solarbio 提供。南京建成生物工程研究所提供Ca2+檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)表法將SD 大鼠分為三組。取30 只生理狀況相同的雄性SD 大鼠按照1 ～30 號(hào)進(jìn)行編號(hào)，將選取的大鼠編號(hào)除以3，得到余數(shù)為0、1 和2。將余數(shù)為0 的大鼠分到假手術(shù)組（Sham 組），余數(shù)為1 的大鼠分到模型組（CIRI 組），余數(shù)為2 的大鼠分到大豆異黃酮組（SI組），每組各10 只。Sham 組：插入線栓但不造成大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞；CIRI 組和SI 組采用線拴法堵塞大腦中動(dòng)脈造模；SI 組造模前21 d，給予SI 灌胃處理（120 mg/kg）。造模前21 d，Sham 組和CIRI 組同時(shí)給予等體積生理鹽水。

1.3.2 動(dòng)物模型制備 采用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立模型。采用10%水合氯醛麻醉大鼠，四肢與頭部固定，在頸正中部位做縱向切口，剝離出大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），CCA 遠(yuǎn)離心臟一端用動(dòng)脈夾夾閉，靠近心臟一端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距離頸總動(dòng)脈分叉部2 ～3 mm 處用血管剪剪出一小口，將栓線沿切口插入并固定，等待2 h 后拔出栓線形成大鼠CIRI 模型，并于造模24 h 后處死大鼠。

1.3.3 大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 再灌注24 h 后根據(jù)大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分表（Zea-Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]）對(duì)三組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。無神經(jīng)功能損傷記0 分；不能完全伸展右前爪記1 分；行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈記2 分；行走時(shí)向右側(cè)傾斜記3 分；不能自發(fā)行走且意識(shí)喪失記4 分；死亡記5 分。記錄該組大鼠各項(xiàng)神經(jīng)功能實(shí)驗(yàn)分值之和，分值越高，代表大鼠腦損傷越嚴(yán)重。

1.3.4 TTC 染色 用0.2 mmol 的PBS 溶液配制濃度為2%的TTC 染液，麻醉大鼠后快速取出全腦。將腦組織在-80℃的冰箱冰凍10 min 后每隔2 mm橫向切片，共切6 片。腦切片置于2% TTC 溶液中，37℃避光水浴30 min 進(jìn)行染色。

1.3.5 大腦梗死率計(jì)算 應(yīng)用Image J 軟件對(duì)病灶腦組織區(qū)域的光密度進(jìn)行分析，記錄光密度值并計(jì)算梗死率。

1.3.6 腦組織HE 染色 分別取三組腦組織于4%的甲醛溶液中固定。進(jìn)行常規(guī)脫水處理、石蠟包埋和制備腦組織切片。切片經(jīng)HE 染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.7 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定 Ca2+含量、SOD 活力、MDA水平采用化學(xué)比色法測(cè)定，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩樣本間數(shù)據(jù)比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較

三組大鼠造模前神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均為0分，神經(jīng)功能正常。造模后出現(xiàn)以下神經(jīng)癥狀，如不能完全伸展右側(cè)前爪、行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈和向右側(cè)傾倒。參照量表標(biāo)準(zhǔn)，再灌注24 h 后，SI 組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與CIRI 組大鼠相比分?jǐn)?shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 三組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死率（± s）

表1 三組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死率（± s）

注 與Sham組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01，與CIRI組比較，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01；CIRI：缺血再灌注損傷；SI：大豆異黃酮

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2.2 三組大鼠腦TTC染色結(jié)果與腦梗死率比較

經(jīng)TTC 染色后，大鼠病灶腦組織區(qū)域?yàn)榘咨２课粸榧t色。Sham 組大鼠腦組織染色結(jié)果顯示為紅色，組織完整，結(jié)構(gòu)對(duì)稱性好，腦梗死率與CIRI 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。CIRI組大鼠腦組織右側(cè)病灶區(qū)域出現(xiàn)白色梗死灶，梗死灶大小不均。SI 組梗死灶面積有所減小，但部分組織切片仍可見小面積白色梗死灶，腦梗死率與CIRI組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖1、表1。

圖1 三組大鼠腦TTC 染色結(jié)果

2.3 三組大鼠腦組織病理切片觀察

HE 染色下光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腦組織結(jié)構(gòu)，Sham 組未見腦組織缺血改變，大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞排列正常，形態(tài)完整，核仁和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。CIRI 組細(xì)胞間隙增大組織疏松，排列紊亂，細(xì)胞核發(fā)生明顯固縮，深染。SI 組同CIRI 組相比，細(xì)胞核發(fā)生固縮的細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞間隙減小。見圖2。

圖2 三組大鼠HE 染色及光學(xué)顯微鏡下觀察（HE 染色，400×）

2.4 三組大鼠腦組織SOD活力、MDA水平和Ca2+含量比較

與Sham 組相比，CIRI 組大鼠腦組織SOD 活力明顯降低，MDA 水平和Ca2+含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。與CIRI 組相比，SI組大鼠腦組織SOD 活力明顯升高，MDA 水平和Ca2+含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 三組腦組織SOD活力、MDA水平及Ca2+含量比較（± s）

表2 三組腦組織SOD活力、MDA水平及Ca2+含量比較（± s）

注 與Sham組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01，與CIRI組比較，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

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3 討論

SI 是一種主要從大豆中提取的三苯基異黃酮類化合物，它與雌二醇類似并具有雌激素樣活力，因此被稱為“植物雌激素”[10]。SI 既有雌激素的藥理學(xué)特性，相比于動(dòng)物雌激素又少有臨床上的一些毒副作用，其明顯的生物學(xué)作用受到業(yè)界廣泛關(guān)注，在抗氧化、抗癌、治療心血管疾病等方面都有重要功效。近年來研究表明，SI 在減輕腦缺血和再灌注損傷中也發(fā)揮一定的作用，其作用與報(bào)道的金雀異黃酮治療腦CIRI 一致[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與CIRI組相比，給予SI預(yù)處理后，大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和腦梗死率明顯降低，這表明SI 能緩解大鼠腦CIRI 引起的神經(jīng)功能障礙。此外，發(fā)生腦CIRI 后，腦組織損傷體現(xiàn)為細(xì)胞核固縮和細(xì)胞水腫等病理變化，而給予SI 預(yù)處理后，細(xì)胞密度增加，核固縮和水腫細(xì)胞數(shù)明顯降低，這些形態(tài)學(xué)改變與大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和腦梗死率趨勢(shì)一致，提示SI 可減輕腦CIRI 后大鼠腦組織病變[12]。

腦CIRI 的病理機(jī)制較為復(fù)雜，目前對(duì)已知引發(fā)腦CIRI 機(jī)制的觀點(diǎn)主要有四種[13]：①氧化應(yīng)激在腦CIRI 中的作用；②興奮性氨基酸毒性在腦CIRI中的作用；③Ca2+超載在腦CIRI 中的作用；④炎癥反應(yīng)在腦CIRI 中的作用。而在這四種機(jī)制中，最主流的是氧化應(yīng)激和Ca2+超載作用誘發(fā)腦CIRI。

SOD 是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能特異性地清除超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷[14]。血液再灌注帶來的氧一方面在黃嘌呤氧化酶的催化作用下變成新的氧自由基，同時(shí)又將氧自由基轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)過氧化物，使得MDA 生成增多，SOD 因消耗而減少，所以常用SOD 活力和MDA 水平來反映腦組織氧化損傷程度[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦CIRI 后，大鼠腦組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平改變、SOD 活力降低、MDA 水平升高，提示大鼠腦組織缺血再灌注后因氧化應(yīng)激造成的損傷加重。本研究表明，腦CIRI 大鼠給予SI 預(yù)處理后能顯著降低MDA 水平，提高大鼠腦組織中SOD 活力。提示SI 可以通過提高SOD 活力，進(jìn)而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕大鼠再灌注期間腦氧化應(yīng)激損傷。

Ca2+超載的發(fā)生一是由于缺血缺氧引起細(xì)胞能量代謝障礙，Ca2+泵的活力受到抑制，Ca2+外流減少，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。二是因?yàn)樵俟嘧⑵陂g，Na+/Ca2+交換體的交換發(fā)生異常[17-18]。當(dāng)大鼠腦缺血再灌注后，缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，內(nèi)流的Ca2+使得線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，引起氧自由基增加，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[19]。因此可以通過檢測(cè)大鼠腦組織Ca2+濃度來評(píng)估腦組織損傷程度[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CIRI 組相比，大豆異黃酮預(yù)處理能夠顯著降低CIRI 大鼠腦組織內(nèi)Ca2+濃度，這提示大豆異黃酮可能通過降低Ca2+超載從而對(duì)大鼠腦CIRI 起保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，SI 可能通過降低CIRI后大鼠腦組織Ca2+超載、減輕大鼠因?yàn)槟X氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的損傷，從而發(fā)揮大鼠腦神經(jīng)保護(hù)的作用。同時(shí)也提示，SI 對(duì)大鼠腦CIRI 的保護(hù)機(jī)制可能在于減輕氧自由基累積和Ca2+超載所造成的聯(lián)合損傷。而對(duì)SI 怎樣作用于Ca2+超載后引發(fā)氧自由基增多的途徑本研究未有探究，具體相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。