餐廚垃圾酸堿度對黑水虻滅活致病菌效率影響

金 寧, 姜 慧 敏, 任 苗 苗, 張 守 玉, 劉 燕 霞,魯 紅 旭, 許 建 強, 賀 高 紅, 徐 衛(wèi) 平*,3

(1.大連理工大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 盤錦 124221;2.大連理工大學(xué) 盤錦產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 遼寧 盤錦 124221;3.大連理工大學(xué) 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室, 遼寧 大連 116024;4.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院, 遼寧 盤錦 124221;5.大連理工大學(xué) 精細化工國家重點實驗室, 遼寧 大連 116024)

0 引 言

隨著我國經(jīng)濟的增長,人們生活水平不斷提高,餐廚垃圾的產(chǎn)量也在不斷增大.據(jù)調(diào)查,我國人均生活垃圾產(chǎn)量約為1.2 kg/d,其中餐廚垃圾占50%以上[1].餐廚垃圾中含有大量未降解有機物,能量密度遠高于糞便、污泥等固體廢棄物,容易發(fā)臭變質(zhì)、滋生細菌,危害公共衛(wèi)生[2].但其中的有機物具有較高的可降解性和生物可利用性,有待資源化處理.

黑水虻(black soldier fly),又名光亮扁角水虻(HermetiaillucensL.),為雙翅目水虻科昆蟲[3],其幼蟲有營腐食性,具有降解有機廢棄物的能力.利用黑水虻資源化處理餐廚垃圾,是近年來逐漸興起的一項有機垃圾處理技術(shù),受到廣泛關(guān)注[4].由于處理產(chǎn)物主要是蟲沙(殘渣剩余物)和蟲體,經(jīng)肥料化和飼料化而循環(huán)使用,所以產(chǎn)物的生物安全性格外重要[5-6].

已有研究表明,黑水虻在處理不同底物時,其滅活致病菌的能力存在顯著差異[7-8].Erickson等[8]報道黑水虻能夠滅活雞糞和豬糞中的大腸桿菌O157(3 d),但不能徹底滅活沙門氏菌.而Lalander等[5]報道黑水虻能夠徹底滅活人糞中的沙門氏菌(7 d).Lopes等[9]報道黑水虻能夠緩慢消減魚類和面包廢棄物中的沙門氏菌和大腸桿菌(14 d).但De Smet等[10]則報道黑水虻對于雞飼料中的沙門氏菌完全沒有消減或抑制能力.可見處理底物對于黑水虻滅活致病菌的效力存在顯著影響,餐廚垃圾中致病菌的滅活規(guī)律亟待分析和闡釋.

底物的酸堿度條件對于致病菌的存活和黑水虻的生長狀況有顯著影響,能否通過調(diào)節(jié)餐廚垃圾的初始酸堿度促進黑水虻生長,同時加速致病菌的滅活值得深入研究.Ma等[11]和Meneguz等[12]的研究表明,黑水虻分別適應(yīng)于pH為6.0～10.0和6.1～9.5的環(huán)境條件,在pH為2.0～4.0的條件下有顯著的死亡和生長速率下降的現(xiàn)象,所以底物酸堿度條件中,中性至堿性范圍更值得深入考察和闡釋.

綜上,本研究以沙門氏菌和大腸桿菌O157為模式致病菌,以不同初始pH條件下餐廚垃圾中致病菌的滅活規(guī)律為研究對象,分析致病菌滅活的主要因素和強化方法,評價餐廚垃圾經(jīng)黑水虻處理的安全性和可行性.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器包括:超凈工作臺(JD-CJ-2S,北京東聯(lián)哈爾儀器),高通量組織研磨器(SCIENTZ-48,寧波新芝),pH計(FE38型,瑞士梅特勒-托利多),高速離心機(5417C,德國艾本德),烘箱(DKM610C,雅馬拓儀器武漢公司).

實驗試劑包括:沙門氏菌選擇性顯色培養(yǎng)基,法國科瑪嘉(CHROMagar);改良大腸桿菌O157選擇性顯色培養(yǎng)基,法國科瑪嘉(CHROMagar);胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB),杭州微生物試劑有限公司;BCA蛋白定量試劑盒,上海生工生物工程有限公司;寬分子量蛋白質(zhì)分子量標記,寶生物工程(大連)有限公司;其他試劑均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司.

1.2 實驗材料的準備

從校園食堂收集餐廚垃圾,使用菜餡機切碎混均,測含水率.添加約濕質(zhì)量10%的麥麩,調(diào)節(jié)餐廚垃圾含水率至65%.使用pH計測量餐廚垃圾的pH為5.3±0.1.使用NaOH將餐廚垃圾初始pH分別調(diào)節(jié)至6.0、8.0、10.0、12.0,保存于4 ℃冰箱中,24 h內(nèi)使用.黑水虻蟲卵購自江蘇安佑生物科技有限公司,蟲卵在豆粕、玉米粉、麩皮質(zhì)量比為6∶3∶1且含水率為65%的物料中于25 ℃孵化6 d后使用.本實驗使用的模式致病菌為鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserovar Typhimurium ATCC14028)和大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157:H7,NCTC12900),購自江蘇南京百思一基生物材料公司,致病菌的培養(yǎng)參照姜慧敏等[13]的研究.

1.3 實驗設(shè)計

本實驗共設(shè)計5個實驗組和5個對照組,分別對應(yīng)pH為5.3、6.0、8.0、10.0和12.0這5個酸堿度條件.實驗組接種致病菌且加入黑水虻.對照組僅接種致病菌而不加黑水虻.每個pH條件下進行2個平行實驗,且沙門氏菌和大腸桿菌的實驗分開進行.實驗過程如下:第0 d將250 g調(diào)節(jié)酸堿度后的餐廚垃圾放入實驗塑料盒中,實驗組和對照組各接種2.5 mL過夜菌液(約108CFU/mL),攪拌均勻后,實驗組加入800只六日齡黑水虻幼蟲(每100只蟲0.037 5 g,800只蟲約0.3 g),對照組不加蟲,蓋上打孔盒蓋.在第0、2、4、6 d采樣,第6 d采樣后,再向各實驗組和對照組中加入250 g調(diào)節(jié)酸堿度后的餐廚垃圾,再次接種2.5 mL過夜菌液(約108CFU/mL),攪拌均勻后,繼續(xù)處理12 d.期間,第7、8、9、10、12、18 d采樣.第18 d采樣后分離蟲沙和蟲體,計數(shù)預(yù)蛹(身體變黑色的幼蟲)比例,稱重蟲沙和蟲體,檢測含水率后冷凍保存.在上述時間點下采集的樣品,于采樣當(dāng)天檢測致病菌數(shù)量(n=4,2個實驗平行×2次檢測平行).同時,每2 d檢測一次物料pH、蟲長和蟲質(zhì)量.另外,第6、12、18 d,從每個實驗盒中采集5～10只黑水虻幼蟲,用于檢測黑水虻體內(nèi)的致病菌數(shù)量.在第9 d從每個實驗盒中采集10只幼蟲,用于檢測抗菌肽蛋白含量和抑菌能力.

1.4 致病菌的計數(shù)

餐廚垃圾及黑水虻幼蟲體內(nèi)致病菌的計數(shù)檢測方法為梯度稀釋和涂布平板計數(shù)法[11].每0.5 g餐廚殘渣樣品加入5 mL PBS緩沖液(pH 7.4),渦旋振蕩,靜置10 min,取上清液,使用PBS緩沖液10倍梯度稀釋后,取100 μL溶液涂在沙門氏菌或大腸桿菌O157的顯色平板上,37 ℃下培養(yǎng)18～24 h,計數(shù).將2～3只洗凈幼蟲,加入10倍質(zhì)量的PBS緩沖液,在高通量組織研磨器內(nèi),于40 Hz下研磨2 min,得到組織勻漿液,靜置10 min,取上清液,通過PBS緩沖液10倍梯度稀釋后,涂平板計數(shù).該計數(shù)方法的檢測極限約為102CFU/g.

1.5 黑水虻抗菌肽的提取與抑菌能力檢測

黑水虻抗菌肽的提取使用含有10%乙酸和0.01 mol/L Na2EDTA的溶液為提取試劑,提取方法及變性凝膠電泳檢測(SDS-PAGE)方法參照文獻[14].以沙門氏菌和大腸桿菌O157為模式致病菌,將抗菌肽粗蛋白稀釋至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的濃度,檢測各濃度下的抑菌率,將抑菌率達到95%的最小蛋白濃度定義為抗菌肽的最小抑菌濃度(MIC),具體檢測方法參照文獻[14].

1.6 理化性質(zhì)檢測與垃圾轉(zhuǎn)化率評價

(1)樣品pH的檢測

將樣品與去離子水按照1∶10的比例混合,振蕩靜置后,通過FE38型pH計讀取pH.

(2)樣品含水率的檢測

將樣品放入105 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重,烘干過程中減少的質(zhì)量比率為含水率.

垃圾減量化率(Rwd)、生物轉(zhuǎn)化率(Rbt)、蟲產(chǎn)率(Rip)和質(zhì)量分配率按下式計算:

(1)

(2)

(3)

mb=mi+mt+mm

(4)

式中:mb為初始餐廚垃圾總干質(zhì)量,mt為處理終止時蟲沙總干質(zhì)量,mi為處理終止時蟲體總干質(zhì)量,mm為處理過程中由于代謝作用所損失的干質(zhì)量.以上所有質(zhì)量均以g為單位.

1.7 統(tǒng)計分析

將平板計數(shù)結(jié)果換算為對數(shù)結(jié)果進行畫圖和統(tǒng)計分析.使用SigmaPlot 12.0進行繪圖,采用R語言的multcomp程序包進行統(tǒng)計差異分析.當(dāng)自變量含有時間因素時,以時間為協(xié)變量進行單因素協(xié)方差分析(ANCOVA),其他情況進行單因素方差分析(ANOVA).將p<0.05的情況定義為差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同初始pH條件下沙門氏菌和大腸桿菌的滅活規(guī)律

不同初始pH條件下,沙門氏菌的減量曲線如圖1所示.由于實驗中,在第0 d和第6 d兩次補充了餐廚垃圾和接種了沙門氏菌,所以沙門氏菌的減量規(guī)律曲線分為第0～6 d和第6～18 d兩條曲線.在第0～6 d,除了pH 12.0條件下無沙門氏菌存活外,其他pH條件下,沙門氏菌均在4 d后被滅活.在第6～18 d實驗組中,pH 6.0和8.0條件下沙門氏菌在接種后1 d被滅活,pH 10.0、5.3、12.0條件下分別在接種后2、3、4 d被滅活.實驗組和對照組在各個pH下,沙門氏菌的減量曲線都不存在顯著性差異.實驗組中,除了pH 12.0條件下以外,沙門氏菌在第6～18 d的滅活速度都快于第0～6 d;而在第6～18 d中,pH 6.0和8.0條件下的滅活速度快于pH 5.3、10.0和12.0的.

圖1 黑水虻處理餐廚垃圾過程中不同初始pH條件下沙門氏菌的減量曲線

不同初始pH條件下,大腸桿菌O157的減量曲線如圖2所示.在第0～6 d,除了pH 12.0條件下無大腸桿菌O157存活外,其他條件下大腸桿菌O157均在4～6 d被滅活.在第6～18 d,實驗組的大腸桿菌O157在pH 6.0、8.0和10.0的條件下于接種2 d后被滅活,在pH 5.3和12.0的條件下于接種4 d后被滅活.實驗組和對照組相比,除了pH 10.0第6～10 d的條件中有差異外(p<0.05),其他pH和時間條件中,均無顯著性差異.實驗組中,除了pH 12.0條件下以外,大腸桿菌O157在第6～18 d的滅活速度都快于第0～6 d;而在第6～18 d中,pH 6.0、8.0和10.0條件下的滅活速度快于pH 5.3和12.0的.

圖2 黑水虻處理餐廚垃圾過程中不同初始pH條件下大腸桿菌O157的減量曲線

對于第6、12、18 d收集的黑水虻樣品,在蟲體內(nèi)均未檢測出沙門氏菌和大腸桿菌O157,說明黑水虻未被致病菌感染.

與已有的致病菌滅活規(guī)律相比,本研究結(jié)果的一個顯著特點是,沙門氏菌和大腸桿菌O157在實驗組(有蟲)和對照組(無蟲)中都被快速滅活,而且對照組和實驗組在多數(shù)條件下無顯著差異,這說明環(huán)境微生物是致病菌滅活的主要因素,而黑水虻并不是主要因素.在Erickson等[8]、Lalander等[5]、Liu等[15]報道的畜禽糞便的研究中,沙門氏菌和大腸桿菌O157在無蟲對照組中均存活了較長時間,說明這兩種模式致病菌在糞便中的存活時間較長,而在餐廚垃圾中的存活時間較短.在滅活時效方面,本研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的滅活時間在1～4 d,大腸桿菌O157的滅活時間在2～6 d,這一時間比Lopes等[9]報道的魚類和面包廢棄物中的14 d(沙門氏菌和大腸桿菌)、Lalander等[5]報道的人類糞便中的7 d(沙門氏菌)時間要短,與Erickson等[8]和Liu等[15]報道的畜禽糞便中的3 d(大腸桿菌)時間相接近,說明環(huán)境微生物對于黑水虻處理過程中致病菌的滅活起到了促進作用[16].De Smet等[10]報道雞飼料中的沙門氏菌難以被黑水虻消減或滅活,而本研究證明了在餐廚垃圾中,沙門氏菌是可以被快速滅活的,這可能與雞飼料的多纖維素環(huán)境、環(huán)境微生物活性弱于餐廚垃圾中的微生物活性有關(guān).在初始酸堿度條件方面,pH 6.0和8.0是同時有利于沙門氏菌和大腸桿菌O157滅活的共性條件,該條件下,兩種致病菌最快可以在1～2 d被徹底滅活,這說明調(diào)節(jié)初始餐廚垃圾的酸堿度是有利于控制處理過程的生物安全性的,而pH 6.0～8.0是優(yōu)勢的初始酸堿度條件.

2.2 黑水虻抗菌肽的提取評價與抑菌能力分析

初始pH條件對黑水虻抗菌肽蛋白濃度(p<0.001)、提取率(p<0.001)和抑菌能力都有顯著影響(圖3).在抗菌肽蛋白濃度和提取率方面,pH 8.0、10.0和12.0組有優(yōu)勢;而在抑菌能力方面,pH 5.3、6.0和8.0組優(yōu)于pH 10.0和12.0組,表現(xiàn)為更小的MIC.蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,所得抗菌肽蛋白粗提物的相對分子質(zhì)量在0～44.3 kDa,不同pH組間抗菌肽相對分子質(zhì)量分布無明顯差異,在29.0、14.3、6.5 kDa附近,有明顯的條帶.

圖3 不同初始pH條件下黑水虻抗菌肽的提取率與抑菌能力評價

餐廚垃圾的初始pH對抗菌肽提取率和抑菌能力有顯著影響,pH 12.0的條件下,雖然抗菌肽提取率高,但是抑菌能力低,而pH 5.3、6.0和8.0的條件下,雖然抗菌肽提取率低,但是抑菌能力高.較高的抑菌能力,有利于黑水虻抵抗微生物侵害,強化對致病菌的滅活,所以pH 5.3、6.0和8.0是有利于強化黑水虻抗菌肽活性的優(yōu)勢條件.該條件下黑水虻抗菌肽的MIC已經(jīng)達到1.0～1.5 mg/mL,這與Lee等[17]報道的經(jīng)干酪乳桿菌針刺感染的黑水虻的MIC(1.0～2.0 mg/mL)十分接近,說明在餐廚垃圾中,不經(jīng)過微生物針刺誘導(dǎo),黑水虻也能產(chǎn)生高活性抗菌肽,這與黑水虻能夠在細菌滋生的腐生環(huán)境下健康存活并轉(zhuǎn)化垃圾的現(xiàn)象相吻合.在相對分子質(zhì)量方面,黑水虻抗菌肽蛋白的相對分子質(zhì)量一般報道為4.2 kDa[18]、4.3 kDa[19]和22 kDa[20]等,蛋白電泳的結(jié)果顯示,所提取的抗菌肽粗提物包含上述相對分子質(zhì)量,是含有黑水虻抗菌肽的蛋白粗提物.

2.3 餐廚垃圾物料pH的變化規(guī)律

由于在實驗的第0 d和第6 d兩次添加了餐廚垃圾,所以物料pH的變化曲線由第0～6 d和第6～18 d的兩條曲線呈現(xiàn),結(jié)果如圖4所示.除了pH 12.0的條件,餐廚垃圾物料在處理的前12 d主要呈現(xiàn)酸性條件,pH在4.0～6.0變化,不受初始pH條件的影響,且實驗組和對照組無差異,然而在第12～18 d,物料pH開始從酸性向中性或弱堿性轉(zhuǎn)變,且在第18 d,實驗組的pH高于對照組的(p<0.05).

圖4 不同初始pH條件下餐廚垃圾物料的pH變化

餐廚垃圾雖然在初始階段被調(diào)節(jié)了pH,但是在處理過程中,仍以酸性為主,這與餐廚垃圾含有大量的碳水化合物、油脂、蛋白等成分有關(guān),這些高能分子在持續(xù)的降解過程中,不斷釋放有機酸,維持系統(tǒng)的酸性,在降解結(jié)束時,物料才從酸性向堿性轉(zhuǎn)變.處理過程的酸性pH顯然有利于致病菌的滅活,同時也證明了高度活躍的環(huán)境微生物的作用.Ma等[11]和Meneguz等[12]同樣調(diào)節(jié)了底物酸堿性,但是在處理過程中,不同組的酸堿性差異明顯,這與Ma等[11]和Meneguz等[12]使用以苜蓿草、玉米粉等纖維素成分為主的底物有關(guān),纖維素類成分釋放有機酸的速度比餐廚垃圾慢,而環(huán)境微生物的活性也可能比餐廚垃圾低,所以處理過程中的pH受物料初始pH的影響更為明顯.Ma等[11]和Meneguz等[12]報道黑水虻分別適應(yīng)于pH 6.0～10.0和6.1～9.5的環(huán)境條件,本研究結(jié)果表明,在餐廚垃圾處理中,從致病菌滅活效率和黑水虻抗菌肽抑菌活性的角度分析,pH 6.0～8.0是餐廚垃圾處理的最優(yōu)初始pH條件,這一結(jié)論與Ma等[11]和Meneguz等[12]的報道基本一致.

2.4 黑水虻生長發(fā)育評價

不同初始pH條件下,黑水虻體質(zhì)量和體長的增長速率存在差異(圖5).pH 6.0和8.0條件下的體質(zhì)量和體長的增長速率顯著高于pH 5.3、10.0和12.0條件下的(p<0.05).第18 d,不同pH組的體長和體質(zhì)量分別達到15.43 mm、0.122 g(pH 5.3),20.11 mm、0.212 g(pH 6.0),20.79 mm、0.226 g(pH 8.0),18.95 mm、0.189 g(pH 10.0)和16.65 mm、0.122 g(pH 12.0).體長和體質(zhì)量增長速度的差異說明pH 6.0和8.0是有利于黑水虻生長代謝的優(yōu)勢條件.

圖5 不同初始pH條件下黑水虻體質(zhì)量和體長的增長

2.5 餐廚垃圾轉(zhuǎn)化效果評價

餐廚垃圾的初始pH對黑水虻預(yù)蛹率無影響(p=0.109),對垃圾減量化率(p<0.001)、蟲產(chǎn)率(p=0.001)、生物轉(zhuǎn)化率(p<0.001)有顯著影響(圖6).其中預(yù)蛹率達到74.8%～88.7%;蟲產(chǎn)率中,pH 6.0(12.7%)、pH 8.0(15.9%)、pH 10.0(16.2%)組高于pH 5.3(10.0%)和pH 12.0(7.9%)組;垃圾減量化率中,pH 5.3～10.0(75.1～79.5%)組高于pH 12.0(51.3%)組;生物轉(zhuǎn)化率中,pH 6.0(16.0%)、pH 8.0(20.0%)、pH 10.0(21.7%)組高于pH 5.3(13.1%)和pH 12.0(15.3%)組.質(zhì)量分配率結(jié)果顯示,不同pH條件下,餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為蟲沙、蟲體以及代謝損失的比例分別為20.5%～48.7%、7.9%～16.2%、43.4%～66.7%,說明餐廚垃圾減量化以黑水虻代謝消耗為主.

(a)預(yù)蛹率

綜合垃圾減量化率和蟲產(chǎn)率的結(jié)果分析,初始pH 6.0～10.0的條件優(yōu)于pH 5.3和12.0的.而在pH 6.0、8.0、10.0中,雖然在蟲產(chǎn)率方面,pH 10.0略高于pH 6.0和8.0的條件,但這可能是因為pH 6.0和8.0的幼蟲生長發(fā)育更快(圖5),提前進入預(yù)蛹期而產(chǎn)生的蟲質(zhì)量下降所造成的[21].所以,通過致病菌滅活速度、抗菌肽抑菌活性、幼蟲生長速率以及垃圾減量化率的綜合分析,初始pH 6.0～8.0是黑水虻處理餐廚垃圾的優(yōu)勢條件,值得應(yīng)用和推廣.0在pH 6.0～8.0的條件下,餐廚垃圾的減量化率達到78.3%～79.5%的水平,在已報道的黑水虻處理餐廚垃圾的減量化率(53%～80%)中[22],為中上游水平,說明黑水虻能夠在降解餐廚垃圾的同時高效滅活致病菌,是餐廚垃圾轉(zhuǎn)化的高效且安全的處理方法.

3 結(jié) 語

餐廚垃圾的初始pH對于致病菌滅活速度、黑水虻抗菌肽抑菌活性和幼蟲生長速率都有顯著影響.環(huán)境微生物以及物料酸性條件是沙門氏菌和大腸桿菌O157滅活的主要因素.黑水虻是垃圾減量化的主要動力,但并不是致病菌滅活的主要因素.調(diào)節(jié)餐廚垃圾的初始pH至6.0～8.0,可顯著促進致病菌的滅活,提高黑水虻抗菌肽抑菌活性,增進幼蟲生長速率,是黑水虻處理餐廚垃圾的優(yōu)勢條件,值得在實踐中應(yīng)用和推廣.