趕黃草泡騰片質(zhì)量評價及抗小鼠酒精性肝損傷的作用

張家偉，廖江龍，黃國琴，熊 飛，稅丕先

西南醫(yī)科大學藥學院（瀘州 646000）

趕黃草是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜（Penthorum chinensePursh）。在四川省古藺縣有廣泛種植，被譽為“神仙草”[1]。《全國中草藥匯編》和《四川中藥志》中記載趕黃草全草入藥具有清熱解毒、利水消腫等功效[2]，在2020 年趕黃草已經(jīng)被列入新食品原料目錄中[3]。研究表明趕黃草具有良好的解酒保肝、抗氧化、抗肝炎病毒等藥理作用[4-5]，趕黃草中槲皮素可以提高機體抗氧化水平[6]。泡騰片遇水迅速產(chǎn)生大量二氧化碳[7]，可作為一種新型的口服劑型，具有吸收快，順應性好、體積小、方便攜帶、反應迅速、生物利用度高等優(yōu)點被廣泛應用[8-9]，近年來泡騰片廣受關注和歡迎，并逐漸向食品和保健品領域拓展，果蔬汁、維生素等被添加進其中[10-11]，作為固體飲料具有十分明顯的保健作用。

酒精性肝損傷是長期飲酒或者短時間內(nèi)大量飲酒對肝臟導致的損害，可造成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化，更有甚者可造成肝硬化、肝癌[12-13]。我國是飲酒大國，隨著物質(zhì)條件的提高，我國每年酒精性肝病病人所占比例逐年上升[14]，但迄今為止還沒有一款對酒精性肝病有很好治療效果的藥物[15]，所以研制一款對酒精性肝病有治療和保護作用的保健產(chǎn)品具有十分重要的意義。本實驗通過兩次酒精灌胃制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，以趕黃草泡騰片（penthorum chinensepursh effervescent tablet，PCPET）的質(zhì)量評價，為趕黃草的進一步研究和開發(fā)提供了新的思路，并具有很好的應用前景。

1 儀器與方法

1.1 材料與試劑

PCPET（實驗室自制）：采用酸堿分別制粒壓片，響應面優(yōu)化篩選最佳原-輔料添加量為：趕黃草浸膏粉10.0%、崩解劑34.0%（檸檬酸：碳酸氫鈉為1：1.4）、甜菊糖苷5.0%、聚乙二醇6 000 6.0%、乳糖45.0%。4%多聚甲醛（批號：70081942），Biosharp 公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（ALT，批號：140121002）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（AST，批號：140221002），聯(lián)科生物；低密度脂蛋白膽固醇試劑盒（LDL-C，批號：142021005）、甘油三酯檢測試劑盒（TG，批號：141721003），mindray公司；超氧化物歧化酶試劑盒（SOD，批號：TBCYWXACDE）、還原型谷胱甘肽試劑盒（GSH，批號：PSKNK8DMNT），Elabcience 公司；56°北京二鍋頭酒（批號：20210522），北京鴻鑫酒業(yè)有限公司；甲醇（色譜純，批號：144282），賽默飛公司。

1.2 儀器與設備

LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀（日本島津公司）；GS8024單沖式壓片機（泰州姜堰德力電機有限公司）；SY-3D 片劑四用測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；D3024R 臺式高速冷凍離心機（美國賽洛捷克SCILOGEX）；UPR-II-10T 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；BS360S 全自動生化儀（邁瑞mindray 公司）；ZF-2D暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）

1.3 方法

1.3.1質(zhì)量評價 采用TLC法建立槲皮素的鑒別方法；按2020 版《中國藥典》制劑通則下對泡騰片的各項要求對PCPET 的片重、重量差異、硬度、脆碎度、產(chǎn)氣量、崩解時限、pH 值等指標進行檢查；采用HPLC 法建立PCPET槲皮素的含量測定。

1.3.2小鼠的分組、造模和給藥 將60只SPF級昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、陽性藥物組（聯(lián)苯雙酯滴丸溶液0.15 g·kg-1）、趕黃草泡騰片高、中、低劑量組（8、4、2 g·kg-1），每組10 只，雌雄各半，參照文獻[16]的方法，分別在給藥后的第7 d和第21 d灌胃56°紅星二鍋頭，劑量分別為0.01 L/kg、0.016 L/kg，空白組灌胃等量生理鹽水，以小鼠肝臟系數(shù)、血清ALT、AST 值來判斷小鼠肝損傷模型是否成功。按照體重0.1 mL/10 g每天灌胃相應藥物一次，連續(xù)灌胃21 d，空白組和模型組灌胃生理鹽水。本研究通過西南醫(yī)科大學倫理委員會審批同意（審批號：20211206-003）。

1.3.3小鼠生化指標的檢測 小鼠第21 d 酒精灌胃后禁食不禁水12 h。眼球取血，靜置2 h，3 500 r/min離心15 min，得到血清，將小鼠頸部脫臼處死、取出肝臟、生理鹽水沖洗干凈并除去多余水分，稱重并計算肝臟系數(shù)，將部分肝-80 ℃低溫凍存?zhèn)溆茫Ｓ嗖糠钟?%多聚甲醛溶液固定備用。

取小鼠血清，按照試劑盒說明書檢測ALT、AST 和LDL-C 的水平。取凍存的肝組織，制成10%的肝組織勻漿，3 500 r/min低溫離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書檢測勻漿中SOD、GSH和TG的水平。

1.3.4肝臟組織病理學觀察 取出固定的肝組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度約為4 μm）再經(jīng)HE染色后，置于生物顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織病變情況

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0 軟件對計量資料進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組間采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量評價

2.1.1PCPET 片重、重量差異、硬度、脆碎度、產(chǎn)氣量、崩解時限、pH 值測定 PCPET 表面光滑、顏色均勻、無松片裂片現(xiàn)象，表面呈淺黃綠色，口味佳，PCPET 中不完整、表面粗糙、色澤不均勻、畸形、有較大花斑或嚴重異物的片劑較少。隨機取20片所制的PCPET片，總重量9.56 g，平均片重0.48 g、平均重量差異為2%，重量差異符合藥典要求。隨機取5片PCPET測得平均產(chǎn)氣量6.5 mL，泡沫細密消散較快，符合藥典對泡騰片產(chǎn)氣量的要求。隨機取3 片PCPET 測得平均硬度33.60 N，硬度適中、脆碎度1.0%、平均崩解時限3'43″均小于5 min、pH 值4.82～5.15 之間呈弱酸性，各檢查指標均滿足《中國藥典》中泡騰片的制劑通則要求。

2.1.2PCPET 薄層色譜鑒別 精密稱定槲皮素對照品20 mg于10 mL容量瓶中加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液；取200 mg 趕黃草浸膏粉和1 g泡騰片粉末分別加入50 mL甲醇溶解、過濾，向濾液中加入5 mL 24%HCl溶液，70 ℃水浴加熱1.5 h，立即冷卻后蒸干，殘渣加甲醇溶解使成10 mL，搖勻，即得趕黃草浸膏供試品溶液和PCPET 供試品溶液；取10 mL 甲醇溶液，作為陰性對照品溶液。以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（5∶4∶1）預飽和10 min，展開，取出，晾干、噴以1 %AlCl3-乙醇溶液，揮干溶劑，置于紫外光燈365 nm下檢視，在供試品色譜中，在與對照品相應的位置顯同顏色的斑點，見圖1。

圖1 3批次PCPET槲皮素薄層色譜圖Figure 1 TLC of quercetin in 3 batches of PCPET

2.1.3PCPET槲皮素含量測定 精密稱定5 mg槲皮素對照品、1g PCPET粉末并按照2.5.2項的方法配制對照品溶液和供試品溶液，以Agilent 5 HC-C18（2）色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，紫外檢測波長360 nm，流動相為甲醇-0.5 %磷酸水（50∶50），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，見圖2、圖3。

圖2 槲皮素HPLC圖Figure 2 HPLC chromatogram of quercetin

圖3 PCPET的HPLC圖Figure 3 HPLC chromatograms of PCPET

精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣質(zhì)量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸分析，得出線性回歸方程：y=4E+06x-32130 R2=1，表明在1 μg～6 μg質(zhì)量范圍內(nèi)有很好的線性關系，見圖4。

圖4 標準曲線圖Figure 4 Standard graph

經(jīng)過測定儀器的精密度良好，槲皮素24 h 穩(wěn)定性良好，方法重現(xiàn)性良好，方法可行。平均加樣回收率100.44%，結(jié)果見表1。取1 g 泡騰片粉末，精密稱定，根據(jù)2.1.2項的方法平行配制3個批次PCPET供試品溶液，精密吸取供試品20 μL進樣，計算峰面積。計算得出制備的PCPET 槲皮素平均含量約為0.76 mg/g，見表2。

表1 方法學試驗結(jié)果Table 1 Methodological test results

表2 槲皮素含量（）Table 2 Quercetin content

表2 槲皮素含量（）Table 2 Quercetin content

2.2 PCPET對小鼠體重、肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響

兩次酒精灌胃以后小鼠均出現(xiàn)了四肢無力、站立不穩(wěn)、腹部抽搐、呼吸急促等不同程度的醉酒狀態(tài)且毛色不光亮、飲食、飲水減少等情況，次日體重均有所下降。結(jié)果顯示模型組平均體重低于空白組，平均肝質(zhì)量增加，與空白組相比肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01），陽性藥物組與模型組相比肝臟指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），PCPET各劑量組的肝臟指數(shù)均低于陽性藥物組，PCPET 各劑量組與模型組肝臟指數(shù)相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果顯示PCPET 具有降低急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)作用，見表3。

表3 PCPET對小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effects of PCPET on liver weight and liver index in mice（，n=10）

表3 PCPET對小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effects of PCPET on liver weight and liver index in mice（，n=10）

注：與空白組比，aP ＜0.01；與模型組比，bP ＜0.05，cP ＜0.01。

2.3 PCPET 對小鼠血清中ALT、AST、LDL-C 的影響

與空白組對比，模型組ALT、AST、LDL-C水平差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明模型制備成功。各給藥組與模型組相比ALT 值降低（P＜0.05）；陽性藥物組、PCPET 中、高劑量組均可降低AST 值（P＜0.05）。各給藥組LDL-C 與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果顯示，PCPET可以通過抑制ALT、AST活性，緩解肝臟受損時脂質(zhì)代謝紊亂的作用從而起到保護肝臟的作用，見表4。

表4 PCPET對小鼠血清中ALT、AST、LDL-C的影響（，n=10）Table 4 Effects of PCPET on ALT，AST，LDL-C in the sera of mice（，n=10）

表4 PCPET對小鼠血清中ALT、AST、LDL-C的影響（，n=10）Table 4 Effects of PCPET on ALT，AST，LDL-C in the sera of mice（，n=10）

注：與空白組比，aP ＜0.01；與模型組比，bP ＜0.05，cP ＜0.01。

2.4 PCPET對小鼠肝勻漿中SOD、GSH和TG的影響

模型組與空白組相比，酒精急性灌胃導致GSH 活性顯著降低（P＜0.01），TG 含量顯著升高（P＜0.01）。PCPET 低、中劑量組和陽性藥物組與模型組相比可以升高受損肝細胞的SOD 活性水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），且不存在劑量依存關系，PCPET低、中、高劑量組和陽性藥物組與模型組相比可增加GSH的活性水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），PCPET中、高劑量組與模型組相比可降低TG水平（P＜0.05）。結(jié)果表明PCPET 可以通過提高SOD 和GSH 的活性作用來保護肝臟，與文獻[17]結(jié)果一致，同時可以降低組織中TG 含量，加速脂質(zhì)代謝，防止肝臟往脂肪肝、肝硬化、肝纖維化等惡性肝病發(fā)展，見表5。

表5 PCPET對小鼠肝勻漿中SOD、GSH和TG的影響（，n=10）Table 5 Effects of PCPET on SOD，GSH and TG in the liver homogenates of mice（，n=10）

表5 PCPET對小鼠肝勻漿中SOD、GSH和TG的影響（，n=10）Table 5 Effects of PCPET on SOD，GSH and TG in the liver homogenates of mice（，n=10）

注：與空白組比，aP ＜0.01；與模型組比，bP ＜0.05，cP ＜0.01。

2.5 PCPET對肝損傷小鼠病理形態(tài)的影響

小鼠肝臟HE 染色后可見空白組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊清晰；模型組小鼠肝細胞病變嚴重，腫脹變形，具有明顯的彌漫性空泡變形，有輕微的炎性浸潤，陽性藥物組結(jié)構(gòu)較為正常，肝細胞空泡變性；PCPET 低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)較正常，未見明顯肝組織結(jié)構(gòu)改變；PCPET 中劑量組見散在少量肝細胞嗜酸性增強；PCPET 高劑量組見散在肝細胞嗜酸性增強且有肝細胞空泡變性。綜上，PCPET 可以減輕模型組肝細胞的空泡變性，維持肝細胞正常結(jié)構(gòu)，減肝細胞的炎性浸潤從而起到保護肝臟的作用，見圖5。

圖5 小鼠肝組織HE染色切片（200×）Figure 5 HE-stained sections of mouse liver tissue（200×）

3 討論

酒精性肝病是危害我國人民健康的主要肝臟疾病[18]，已經(jīng)成為繼甲肝、乙肝后最大的肝類疾病，且逐漸年輕化，酒精性肝損傷病人占肝病病人的比例逐年升高[19]。肝臟是人體代謝酒精重要的器官，酒精代謝產(chǎn)生大量的乙醛，對肝臟有毒性作用，影響線粒體ATP生成，導致細胞脂肪和蛋白質(zhì)分泌受阻，進而導致更嚴重的肝臟疾病[20-21]，酒精是極具滲透性的小分子有機物，當人體大量攝入酒精以后，會誘導細胞產(chǎn)生大量自由基，造成肝臟的直接損傷。酒精性肝病發(fā)病機制復雜，涉及到多因素共同作用[22]，以往研究顯示，趕黃草可以通過抑制氧化應激水平、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制肝臟炎癥反應起到保護肝臟的作用[23]。

2020版《中國藥典》中規(guī)定泡騰片的崩解時間要小于5 min，但是中藥浸膏泡騰片常存在崩解超限的情況，導致質(zhì)量不合格，本研究在PCPET的制備初期同樣出現(xiàn)過這個問題。除了與崩解劑的種類、用量、加入方式有關外，也與浸膏粘度相關，粘度大影響水分進入片劑內(nèi)與崩解劑發(fā)生反應。在質(zhì)量評價中，2020版《中國藥典》規(guī)定要求崩解溫度在25 ℃左右，測定發(fā)泡量的液體溫度在37 ℃左右，接近體溫，推測是以泡騰片體內(nèi)反應溫度作為考評，如陰道泡騰片。本實驗測定的崩解時間以及產(chǎn)氣量只是剛好滿足藥典的要求，質(zhì)量不佳。本實驗認為藥典規(guī)定的測量溫度不適用于PCPET 的評價體系，作為一種固體飲品，可用溫水服用，且對槲皮素等營養(yǎng)成分不會產(chǎn)生破壞作用，所以建議適當提高測定溫度的范圍，這樣既符合質(zhì)量標準，又符合實際服用情況。

PCPET 雖然是實驗室自制的功能性飲品保健品，但通過制備工藝的優(yōu)化、質(zhì)量初步評價，實現(xiàn)了工藝簡單、質(zhì)量穩(wěn)定、療效優(yōu)良的效果，為未來投入生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本實驗通過對小鼠兩次酒精灌胃沖擊成功制備了急性酒精性肝損傷模型，測定了ALT、AST、LDL-C、SOD、GSH 和TG 的水平，肝臟病理組織切片結(jié)果顯示PCPET 對ALT、AST 的酶活性有降低作用，可以提高抗氧化水平及脂質(zhì)代謝，表明PCPET 對急性酒精性肝損傷具有很好的保護作用。研究表明槲皮素是趕黃草保肝的主要活性成分，采用TLC對PCPET中槲皮素鑒別，應用HPLC法對槲皮素的含量進行測定，對實驗室自制的PCPET進行質(zhì)量評價可以建立質(zhì)量標準。

綜上所述，PCPET 對急性酒精性肝損傷有很好的保護作用且質(zhì)量穩(wěn)定，為趕黃草的深度開發(fā)提供了方向，為酒精性肝損傷防治相關的功能性食品、保健品開發(fā)也提供了有效研究基礎。