建立與青年大鼠神經(jīng)功能損傷程度相同的老年大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型

李祥龍，陳香州，雷圍程，李立東，李 堯，楊福兵，楊曉波

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科（瀘州646000）；2.四川省神經(jīng)外科臨床研究中心（瀘州646000）；3.西南醫(yī)科大學(xué) 科技處（瀘州 646000）

腦梗塞是老年人群常見疾病，是人類最常見的致殘?jiān)颉４竽X中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是研究腦缺血性中風(fēng)的常見動(dòng)物模型[1-2]，主要用于探索發(fā)病機(jī)制及新藥研發(fā)。

在青老年兩個(gè)年齡組之間的動(dòng)物對(duì)照性實(shí)驗(yàn)已經(jīng)用于一些藥物的研發(fā)。遺憾的是，在這些對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，兩組動(dòng)物模型的腦損傷程度不一致導(dǎo)致了一些干預(yù)措施或治療效果的評(píng)估結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，一些在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中效果良好的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)后，效果不盡人意[3-4]，動(dòng)物模型的偏倚大大浪費(fèi)了研發(fā)資源。本研究通過調(diào)整腦血流量的方法[5-6]，控制大鼠腦損傷程度，從而建立一種與青年大鼠神經(jīng)功能損傷程度一致的老年大鼠MCAO 模型。用在青年、老年組之間的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，研究藥物療效及毒理學(xué)機(jī)理等，避免了因動(dòng)物模型偏倚引起的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

青年雄性SPF級(jí)SD大鼠（2月齡，280～300 g）及老年雄性SPF 級(jí)SD 大鼠（20～22 月齡，750～800 g）被飼養(yǎng)在濕度（63%～65%）及溫度（23～25°C）適宜的環(huán)境里，定時(shí)喂養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)中，使用專用動(dòng)物麻醉裝置（R540，瑞沃德，中國）通過異氟烷吸入麻醉大鼠。所有實(shí)驗(yàn)流程都獲得西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過（編號(hào)：KY2017035）。

1.2 通過實(shí)驗(yàn)確定老年大鼠線栓規(guī)格

本研究中的MCAO 模型制作是參考LONGA 和KUTLUAY 報(bào)道的方法[7-9]。線栓經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處‘a(chǎn)’點(diǎn)插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至大腦中動(dòng)脈起點(diǎn)‘b’，從而阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。參考已有研究，該實(shí)驗(yàn)中青年大鼠的線栓硅膠頭直徑和插入深度‘a(chǎn)b’分別是0.32 mm 和（18 ± 2）mm[8-10]。通過解剖15 只老年大鼠頭顱，測得‘a(chǎn)b’長度為（22±2）mm，見圖1A。為了獲得線栓硅膠頭直徑大小，本研究納入30 只老年大鼠，采用不同硅膠頭直徑建立3 組MCAO 模型：0.32 mm 組，0.43 mm 組，0.52 mm 組。通過術(shù)后第3 d TTC 染色，結(jié)果提示，0.52 mm 組大鼠腦梗死嚴(yán)重（45.9±5）%，0.32 mm 組腦梗死不明顯（0±1）%，0.43mm 組腦梗塞面積為（16.2±8）%，見圖1B。術(shù)后7 d 內(nèi)大鼠生存率統(tǒng)計(jì)提示0.52 mm 組大鼠死亡率為80.2%，明顯高于0.43 mm組大鼠（29.6%），見圖1C。因此，0.43 mm硅膠頭更適合用于老年大鼠MCAO模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同型號(hào)線栓引起老年大鼠腦梗死情況Figure 1 Degree of cerebral infarction caused by different size of suture in aged rat

1.3 建立與青年大鼠神經(jīng)功能損傷程度一致的老年大鼠MCAO模型

大鼠被隨機(jī)分為4 組：青年假手術(shù)組（n=20），老年假手術(shù)組（n=20），青年MCAO 組（n=20），老年MCAO 組（n=20）。青年MCAO 組大鼠在顯微鏡下被分離右側(cè)頸動(dòng)脈，并用動(dòng)脈瘤夾夾閉頸總動(dòng)脈，將線栓硅膠頭直徑0.32 mm、插入深度（18±2）mm插入右側(cè)大腦中動(dòng)脈起始部，老年MCAO 組采用線栓硅膠頭直徑0.43 mm、插入深度（22±2）mm插入右側(cè)大腦中動(dòng)脈起始部，線栓均在1 h 后取出。青年假手術(shù)組、老年假手術(shù)組行頸總動(dòng)脈解剖暴露，用動(dòng)脈瘤夾夾閉10 s 后松開，不塞入線栓[11]。收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、pH 值、動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）、血糖值在整個(gè)造模操作中持續(xù)監(jiān)測。

右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)皮質(zhì)的局部腦血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）通過激光多普勒血流儀（Module LDF100c Biopac Systems，Inc.，USA）持續(xù)監(jiān)測[12-13]。在大腦中動(dòng)脈阻塞前、阻塞后即刻開始分別監(jiān)測5 min，阻塞前的rCBF 值作為基線值，阻塞后的rCBF 值與基線值的比值作為阻塞后腦血流量，以此用于統(tǒng)計(jì)分析。激光多普勒血流儀探頭通過一個(gè)頭皮切口放置于青年大鼠右側(cè)冠狀縫后方2 mm，旁開6 mm處（老年大鼠為右側(cè)冠狀縫后3 mm，旁開8 mm）[14-15]，通過調(diào)節(jié)線栓位置控制rCBF值。

1.4 損傷程度的一致性評(píng)價(jià)

術(shù)前、術(shù)后第1、3、7、21 d 作為神經(jīng)功能評(píng)價(jià)的時(shí)間點(diǎn)，用改良的神經(jīng)功能評(píng)分（modified Neurology Severity Score，mNSS）、角測試評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷情況[16-18]。mNSS采用18分評(píng)分系統(tǒng)，主要從運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡、反射四方面評(píng)價(jià)，分?jǐn)?shù)越高損傷越重。角測試中，將大鼠放在成30°夾角的兩塊木板間，大鼠爬進(jìn)夾角后轉(zhuǎn)彎爬出，正常大鼠從左側(cè)或右側(cè)爬上木板，而腦缺血損傷的大鼠則偏向于從非癱瘓側(cè)（本實(shí)驗(yàn)中為右側(cè)）爬上木板，然后轉(zhuǎn)頭返回出口。每只大鼠重復(fù)檢測10次，從右側(cè)轉(zhuǎn)向的次數(shù)記為R，從左側(cè)轉(zhuǎn)向的次數(shù)記為L，因此R+L=10，而R/R+L 則表示大鼠的癱瘓程度，值越大表示癱瘓?jiān)絿?yán)重，值越小表示癱瘓?jiān)捷p微。

通過TUNEL 試劑盒（Roche Applied Science，Germany）檢測建模后第3 d 缺血損傷區(qū)細(xì)胞死亡的情況[19-21]。大鼠腦標(biāo)本在切片機(jī)上切為6 μm 厚度的切片用于檢測，共聚焦熒光顯微鏡下，通過Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，USA）系統(tǒng)計(jì)數(shù)細(xì)胞及采集圖片，每張切片取6個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL-陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量資料以表示，通過單因素方差分析進(jìn)行組間比較，用log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存率比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過調(diào)節(jié)線栓深度，大鼠rCBF被控制在一個(gè)穩(wěn)定的水平，青年大鼠調(diào)節(jié)為基線血流的（15±3）%，老年大鼠調(diào)節(jié)為基線血流的（25±2）%，見圖2。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠的rCBF值Figure 2 rCBF values of rats in each experimental group

通過mNSS及角測試，MCAO大鼠神經(jīng)功能在腦缺血后第1 d 和第3 d 損傷明顯，且青年MCAO 組與老年MCAO 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），隨后大鼠神經(jīng)功能開始恢復(fù)，但老年大鼠比青年大鼠恢復(fù)慢，21 d時(shí)，老年MCAO組神經(jīng)功能比青年MCAO組差，見圖3。

圖3 mNSS及角測試對(duì)大鼠的神經(jīng)功能評(píng)估Figure 3 Neurological function of rats was evaluated by mNSS and Corner test

術(shù)中監(jiān)測顯示，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠的SBP、pH 值、PaO2、PaCO2、血糖值在MCAO 術(shù)前、術(shù)后無明顯波動(dòng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠術(shù)中生理參數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of physiological parameters in each group during operation

TUNEL 試劑盒檢測結(jié)果顯示，在缺血損傷后第3 d，青年MCAO 組、老年MCAO 組腦梗死區(qū)域的細(xì)胞死亡率（青年MCAO 組為31%，老年MCAO 組為32%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 大鼠腦梗塞區(qū)域細(xì)胞死亡情況Figure 4 Cell death in cerebral infarction area of rats

3 討論

嚙齒類動(dòng)物MCAO 模型由于其操作簡便、成本低廉，被廣泛用于腦缺血疾病的研究[22-24]。該模型能模擬人類缺血性腦中風(fēng)的病理生理過程，且腦缺血損傷程度可控，無需開顱操作避免了腦組織機(jī)械性損傷[14，25-26]，減少了動(dòng)物模型導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏倚。然而，現(xiàn)有的研究多數(shù)都使用的青年嚙齒類動(dòng)物，特別是在青老年群體對(duì)比性研究中，缺乏兩年齡段損傷程度一致的模型，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估不準(zhǔn)確。人腦缺血性中風(fēng)后，腦水腫在發(fā)病后3～7 d內(nèi)最嚴(yán)重，神經(jīng)功能缺失也最明顯[27]，這反映了早期腦損傷的嚴(yán)重程度，直接決定后期神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。本文建立青年、老年兩年齡組大鼠神經(jīng)功能損傷一致的MCAO 模型，能模擬人腦3～7 d神經(jīng)功能缺失最嚴(yán)重的狀態(tài)。該模型可用于早期藥物干預(yù)效果及機(jī)制研究，直接觀察干預(yù)手段對(duì)兩個(gè)年齡組個(gè)體的作用差異及其機(jī)理，避免兩組模型損傷程度差異造成的結(jié)果偏倚。

在本研究中，通過調(diào)節(jié)rCBF 控制腦缺血損傷程度，建立青年、老年兩年齡組大鼠術(shù)后3 d 內(nèi)神經(jīng)功能損傷程度一致的MCAO 模型，克服了以往研究中該模型的缺點(diǎn)。本研究分兩部分完成，線栓硅膠頭直徑和插入深度是最關(guān)鍵的參數(shù)，以往研究中沒有相關(guān)文獻(xiàn)，第一部分實(shí)驗(yàn)通過探索獲得了較為理想的老年大鼠線栓相關(guān)數(shù)據(jù)：硅膠頭直徑0.43 mm，插入深度為（22 ±2）mm。第二部分實(shí)驗(yàn)中，通過調(diào)節(jié)rCBF，建立兩年齡組損傷程度相同的MCAO模型。

以前研究報(bào)道，在青年大鼠MCAO模型中，rCBF一般降低至基線值的30%可以獲得比較合適的腦損傷程度[14-15]。本研究通過調(diào)整線栓的位置來控制rCBF 大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)年齡組中，不同的rCBF可以獲得一致的神經(jīng)功能損傷程度，可能是青年大鼠比老年大鼠有更強(qiáng)的腦缺血代償能力所致。結(jié)果顯示青年及老年MCAO組大鼠在手術(shù)后1、3 d神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，且程度一致，之后開始逐漸恢復(fù)，老年大鼠恢復(fù)更差。青年假手術(shù)組、老年假手術(shù)組rCBF分別降低為基線值的94.9%、92.5%，可能是頸動(dòng)脈夾閉后血管痙攣所致。術(shù)中生命體征持續(xù)監(jiān)測結(jié)果顯示SBP、pH、PaO2、PaCO2、血糖值在線栓插入前后無明顯差異，提示該實(shí)驗(yàn)中線栓型號(hào)合適，能在維持穩(wěn)定的生命體征前提下獲得理想的腦梗塞程度。在缺血損傷后第3 d，TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)青年MCAO組與老年MCAO組腦梗死區(qū)域的細(xì)胞死亡率相同，證明本研究方法能在病理層面做到損傷程度一致，為以后腦中風(fēng)機(jī)制研究提供了參考依據(jù)。

4 結(jié)論與啟示

本研究成功建立了神經(jīng)功能損傷程度相同的青年、老年大鼠MCAO模型，可避免因動(dòng)物模型偏倚引起的腦缺血藥物療效及毒理學(xué)機(jī)理等研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。但本研究中使用的大鼠年齡及重量是有限定要求的，其他年齡及重量的大鼠還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，這也是本研究的局限性。