確定性篩選設計優化鈣DK咀嚼片工藝及穩定性因素研究

張美萍，李曉慧，牛健，陳超，田密

北京振東光明藥物研究院有限公司（北京 100085）

鈣維生素DK咀嚼片是以鈣、維生素D3（VD3）、維生素K2（VK2）為原料制成的營養素補充劑，可以防治骨質疏松[1]和血管鈣化[2-3]。鈣是維持骨骼健康的主要營養素，對預防和治療骨質疏松癥起到重要作用[4]。維生素D3能夠增加腸道鈣吸收，維持機體鈣平衡[5]。維生素K2可以活化骨鈣蛋白與鈣離子結合，刺激成骨細胞分化、促進骨形成[6-7]，此外還具有改善血管鈣化等作用[8-9]。

鈣維生素DK咀嚼片制備工藝：原輔料混合→濕法制?！稍铩！偦臁鷫浩b。

濕法制粒[10]得到的顆粒粒徑如果相差太大，會影響產品混合效果，從而影響營養素的含量均勻性，同時還會造成壓片過程中片重不穩；總混工藝同樣會影響產品中營養素的含量均勻性，制粒和總混是產品生產過程中的關鍵工藝，需要重點考察和控制。

相較于正交設計和響應面設計在考察因素較多的情況下，需要的試驗次數較多[11]，試驗選用的確定性篩選設計（definitive screening design，DSD）[12]能夠僅用較少的試驗次數實現對10個因素的篩選和優化，極大地節省試驗成本[13-14]。此產品中含兩種脂溶性維生素VD3、VK2，其化學性質極不穩定，與鈣配伍時，其穩定性是產品開發的極大挑戰[15-16]。此次試驗考察了糖醇添加量、顆粒水分、光照、氧氣對產品穩定性的影響，為產品的商業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2 000 ppm維生素K2（德國Gnosis）；0.25%維生素D3（廈門金達威生物科技有限公司）；0.015 mm碳酸鈣（上海諾誠藥業股份有限公司）；山梨糖醇（保齡寶生物股份有限公司）；麥芽糊精、聚維酮K30、二氧化硅（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；三氯蔗糖（山東三和維信生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

SYH-10三維運動混合機（常州市高強干燥設備有限公司）；HS-200三維運動混合機（江蘇星星干燥設備有限公司）；HLSG-10P高效混合制粒機（浙江明天機械有限公司）；FG-50沸騰干燥機（江蘇國朗機械制造有限公司）；C&C800旋轉式壓片機（北京創博佳維科技有限公司）；Xse205分析天平（Mettler）；Waters e2695高效液相色譜（Waters科技有限公司）；PinAAcle900T原子吸收光譜儀（Perkein Elmer）；Labonce-250GS穩定性試驗箱（北京蘭貝石恒溫技術有限公司）；HX/HS快速水分測定儀（梅特勒-托利多有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 產品濕法制粒輔料及工藝優化

共選擇3個輔料變量和2個工藝變量（表1）用于確定性篩選試驗設計，每個變量設置3個水平，以顆粒合格率（0.250 mm＜d＜0.850 mm）為響應，利用JMP 13.0軟件DSD進行實驗設計。

表1 制粒DSD因素和水平

將碳酸鈣、麥芽糊精、山梨糖醇混合均勻后，添加聚維酮K30溶液（添加量為混合粉質量的15%）進行制粒，濕顆粒置于沸騰干燥機中（溫度50~55 ℃）干燥，干顆粒用篩分法測定粒徑分布。

1.3.2 產品總混工藝優化

根據1.3.1小節篩選出的最佳配方和工藝制粒，制得的干顆粒與VD3、VK2、三氯蔗糖、二氧化硅混合。共選擇1個輔料變量和4個工藝變量（表2）用于確定性篩選試驗設計，每個變量設置3個水平，以VD3混合均勻度變異系數為響應值。VD3混合均勻度變異系數（C.V.）通過同一批次10個樣品中VD3含量的平均值（X）和標準差（S）計算得到[17]，C.V.值越大，混合均勻度越差。均勻度變異系數按式（1）計算。

表2 混合DSD因素和水平

1.3.3 產品最優配方及工藝驗證

根據DSD篩選的最優配方及工藝參數放大3批進行驗證（56 kg/批），檢測其顆粒合格率、VD3混合均勻度及含量、鈣含量、VK2含量[18]，并對片劑感官、脆碎度和片重差異進行檢測。VD3含量檢測方法：《中國藥典 四部 2020版》；鈣含量檢測方法：GB 5009.92[19]。

1.3.4 影響產品穩定性因素考察

1.3.4.1 不同山梨糖醇添加量對VD3、VK2穩定性影響

將山梨糖醇添加量分別調整為0，10%，20%，30%和40%，麥芽糊精添加量分別對應為40%，30%，20%，10%和0，制得干顆粒后與其他原輔料混合均勻，壓片（1.0 g/片），用白色塑料瓶密封包裝，置于穩定性箱（溫度37±2 ℃，相對濕度75%±5%）3個月，分別于0，1，2和3月檢測VD3和VK2含量，并計算穩定性，每個試驗重復3次。穩定性按式（2）計算。

式中：W0為0月維生素含量，μg/片；Wn為加速后維生素含量，μg/片；n為1，2和3月。

1.3.4.2 不同顆粒水分對VD3、VK2穩定性影響

將制粒后的濕顆粒干燥水分分別控制在2%，5%，8%和11%時得干顆粒，其余步驟參照1.3.4.1小節進行穩定性考察。

1.3.4.3 不同包裝條件對VD3、VK2穩定性影響

將制備的樣品分別置于白色塑料瓶、棕色塑料瓶、透明塑料瓶、白色塑料瓶（加脫氧劑）密封包裝，參照1.3.4.1小節進行穩定性考察。

1.3.5 數據處理

每組數據結果以平均值±標準誤差表示，采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 產品濕法制粒輔料及工藝優化

根據表3試驗設計對聚維酮K30溶液濃度、麥芽糊精添加量、山梨糖醇添加量、制粒時間和干燥時間進行優化，以顆粒合格率為評價指標，試驗結果如表3所示。

表3 制粒DSD試驗設計及結果

對以上試驗數據進行向前逐步多元回歸，按式（3）計算。

模型的R2為0.953，P為0.001 4，說明該模型擬合較好且顯著（P＜0.01）。結果顯示，聚維酮K30溶液濃度（X1）和制粒時間（X4）對顆粒合格率有影響但不顯著（P＞0.05），而X1與X4有顯著的二階交互作用（P＜0.01），此外X1的二階平方項也顯著影響（P＜0.01）。結果顯示X1與顆粒合格率負相關，X4與顆粒合格率正相關。聚維酮K30濃度過高會導致粉末黏性過大，搖擺制粒時不易成粒且粘篩網，造成顆粒合格率下降。制粒時間延長能夠提高原輔料的黏性，黏合劑用量也應相應降低，在制粒時不能忽略兩者的交互作用而單獨調整其中一個參數。根據DSD優化結果，聚維酮K30溶液濃度（X1）為14.4%，制粒時間（X4）為300 s時，顆粒合格率最高。

2.2 產品總混工藝優化

姜艷喜等[20]發現粉體顆粒的水分一定程度上影響顆粒間的黏著力及顆粒與容器壁的附著力，從而影響混合效果。利用DSD試驗設計對顆粒水分、二氧化硅添加量（潤滑劑）、裝載系數、混合轉速和混合時間進行考察和優化，以VD3混合均勻度變異系數（C.V.值）為評價指標（VD3添加量最小為0.25%），C.V.值越小說明混合均勻性越好。試驗結果如表4所示。

表4 總混工藝DSD試驗設計及結果

對以上試驗數據進行向前逐步多元回歸，按式（4）計算。

模型的R2為0.957，P為0.000 6，說明該模型擬合較好且顯著（P＜0.01）。結果顯示裝載系數（X8）和混合時間（X10）對混合均勻性有顯著影響（P＜0.01），此外X10的二階平方項也顯著影響（P＜0.01）。結果顯示X8與混合均勻性負相關，X10與混合均勻性正相關。在產品商業化生產中裝載系數過小，混合時間較長會導致產品生產成本增加，在滿足產品混合均勻性前提下，應適當提高裝載系數，減少混合時間，以縮短產品生產周期。根據DSD優化結果，裝載系數（X8）為0.4，混合時間（X10）為22 min時，VD3混合均勻性最好。

2.3 產品最優配方及工藝驗證

按照DSD優化得到的最優配方及工藝參數（表5），進行3批次產品驗證，結果見表6。

表5 優化配方及工藝參數

表6 驗證試驗結果

按照表5參數設計進行3批產品工藝放大驗證，結果顯示（表6）：3批產品的顆粒合格率均良好，與擬合結果吻合，能夠滿足壓片要求；C.V.值均不超過5%，證明混合均勻性良好；功效成分鈣、VD3、VK2含量均合格；感官、脆碎度及片重差異均符合要求，說明經過優化后的產品工藝穩定，質量合格，能夠用于大生產。

2.4 影響產品穩定性因素考察

2.4.1 不同山梨糖醇添加量對VD3、VK2穩定性影響

糖醇類輔料因在制劑中能與大多數原料配伍、可壓性好、口感好等優勢被廣泛應用于片劑中[21]。但糖醇具有引濕性，可能對產品的穩定性產生一定的影響。山梨糖醇不同添加量對VD3、VK2穩定性的影響結果見表7。

表7 山梨糖醇不同添加量VD3、VK2穩定性結果（n=3）

由表7數據可知，山梨糖醇添加量對片劑中VK2穩定性影響較大，添加量與VK2穩定性呈負相關。添加量為0和10%時，加速3個月穩定性分別為91.21%和89.23%，兩者無顯著性差異（P＞0.05），這與Orlando等[16]的研究結果基本一致：VK2與碳酸鈣配伍加速3月穩定性超90%。添加量高于10%時，均顯著影響了VK2含量穩定性，而山梨糖醇的添加量對VD3穩定性影響較小，原因可能是VD3原料經過了微囊化包埋，而VK2原料未進行包埋導致其穩定性差。侯志遠等[22]認為可以通過原輔料相容性試驗排除與VD3有作用的輔料，得到的輔料可以成為VD3的“保護傘”，改善VD3在復方固體制劑中的穩定性，此產品中麥芽糊精相比山梨糖醇更能夠對VK2起到“保護”作用，可適當降低山梨糖醇的添加量，這也提示企業在進行同類產品開發時，應注意糖醇類輔料對VK2穩定性的影響。

2.4.2 不同顆粒水分對VD3、VK2穩定性影響

水分是很多化學反應的介質，過多的水分會軟化維生素微粒，增加氧氣和水分的滲透性，破壞維生素穩定性[23]。制粒工藝中黏合劑溶液的添加是引入水分的主要途徑，顆粒經過干燥可以去除大部分水分，試驗通過控制干燥時間將顆粒水分分別調整到2%，5%，8%和11%，以考察水分對VD3、VK2穩定性的影響，結果如表8所示。

表8 不同顆粒水分VD3、VK2穩定性結果（n=3）

由表8數據可知，顆粒的含水量對片劑中VD3和VK2穩定性都有影響，水分含量與穩定性呈負相關。顆粒水分為2%和5%時，加速3個月VD3和VK2穩定性均能達到80%以上，穩定性較好，兩者無顯著性差異（均P＞0.05），顆粒水分含量高于5%時，加速3月后VD3和VK2穩定性均顯著低于顆粒水分為2%時（均P＜0.01）。為了節約能源同時縮短產品生產周期，該產品顆粒干燥水分控制在5%左右即可。

2.4.3 不同包裝條件對VD3、VK2穩定性影響

Begari等[24]研究發現VK2對光比較敏感，在生產、儲存及使用過程中采取適當的避光措施，可以降低VK2的分解率。孫健等[25]將配方粉進行48 h光照后，VK的留存率不足70.0%，建議配方粉包裝盡可能選擇阻光阻氧的包裝材質，以降低光照因素對其產生的影響。此產品不同包裝條件對VD3、VK2穩定性影響試驗結果見表9。

表9 不同包裝條件對產品中VD3、VK2穩定性影響結果（n=3）

利用不同包裝條件考察光照、氧氣對VD3、VK2穩定性的影響，結果如表9所示。樣品分別用白色、棕色、透明塑料瓶包裝，VD3經3個月加速穩定性分別為91.34%，91.21%和78.67%，透明塑料瓶3月穩定性顯著低于白色塑料瓶（P＜0.01），表明光照會影響VD3穩定性。棕色與白色塑料瓶相比差異不顯著（P＞0.05）。內置脫氧劑對VD3穩定性影響不顯著（P＞0.05），可能是因為VD3包埋壁材起到隔絕氧氣的作用。VK2經3個月加速穩定性分別為87.39%，88.27%和61.20%，透明塑料瓶3月穩定性顯著低于白色塑料瓶（P＜0.01），表明光照同樣影響VK2穩定性。棕色與白色塑料瓶相比差異不顯著（P＞0.05），說明白色塑料瓶內同樣含有遮光物質，能夠滿足產品對阻光的要求。內置脫氧劑顯著改善其穩定性（P＜0.01），表明氧氣對VK2穩定性有影響。此產品在生產及儲存過程中應盡量避光，企業在成本允許的條件下包裝時盡量使用脫氧劑。

3 結論

目前VD3、VK2與鈣配伍的產品，混合均勻性和穩定性是兩大技術性難題，尤其是VK2穩定性研究方面的報道較少。此研究通過DSD優化了制粒和混合工藝參數，用較少次數的試驗完成了共10個變量的優化，經過優化后的產品混合均勻性良好，且經過放大驗證能夠在工業化生產中應用。同時對影響產品VD3、VK2穩定性的因素進行了考察，提高了產品的穩定性。文章針對這兩個問題進行重點研究，研制的產品混合均勻性和穩定性均能符合要求，下一步可對配伍的輔料種類進行重點篩選優化，以得到口味更佳、穩定性更好的產品。