Box-Behnken響應面法優化五味子醇甲提取工藝

艾佳佳，黃慧芝，劉海燕，侯春久，湯燦輝，陳文

1.江西中醫藥高等專科學校（撫州 334400）；2.臨川區第一人民醫院（撫州 334400）

五味子臨床用于治療肝炎、抗腫瘤及抗病毒等[1]，是由于其含有木脂素類成分[2]，其中以含量較高，具有聯苯木脂素的五味子醇甲為代表。五味子醇甲提取工藝中，采用最頻繁的方法為加熱回流提取法，該提取工藝較為成熟，但存在一些不足，如提取時間長、消耗能源大及操作較繁瑣等[3]。

超聲提取法是一種采用超聲波能量，破壞植物藥材的細胞，并幫助溶劑進入細胞內，溶解天然藥物化學成分的一種提取方法。該方法操作簡單，成本較低，高效便捷[4]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-M20A型檢測器、CTO-20A型柱溫箱、SIL20A型自動進樣器，日本島津公司）；MS105DU型分析天平（梅特勒托利多有限公司）；BAS2202S型電子天平（賽多利斯公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

五味子醇甲對照品（含量99.7%，批號110857-201815，中國食品藥品檢定研究院）；五味子（江西中醫藥高等專科學校附屬醫院）；β-環糊精（批號20201007，天津市大茂化學試劑廠）；無水乙醇（分析純）；甲醇（色譜純）。

1.3 試驗方法

1.3.1 五味子醇甲含量測定分析方法的建立

1.3.1.1 含量測定方法

1.3.1.1.1 色譜條件的確定

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水（13︰7）為流動相，檢測波長250 nm[6]。

1.3.1.1.2 標準溶液的配制

取適量五味子醇甲對照品，精密稱定，加甲醇制備成每1 mL含1 514.00 μg的標準儲備液。

1.3.1.1.3 供試品溶液的配制

五味子打粉，精密稱取，置于10 mL容量瓶中，加甲醇，定容，超聲，至五味子充分溶解，補充甲醇，至刻度，過濾，取續濾液，即得。

1.3.1.2 含量測定方法學考察

1.3.1.2.1 線性關系考察

取五味子醇甲對照品母液，分別精密吸取1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，取0.45 μm微孔濾膜，過濾，取續濾液，注入高效液相色譜儀，檢測。以峰面積y為縱坐標，濃度x為橫坐標，進行線性回歸，其回歸方程為y=29.571x+3 410.9，R2=0.998 8。

1.3.1.2.2 精密度考察

取10 μL同一對照品溶液，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，五味子醇甲對照品溶液SRSD為0.88%，說明高效液相儀器精密度良好。

1.3.1.2.3 穩定性考察

取同一供試品溶液，常溫放置，分別于0，2，4，8，12和24 h進樣分析，注入液相色譜儀進樣分析，SRSD為0.79%，說明穩定性良好，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

1.3.1.2.4 重復性考察

按上述供試品溶液配制方法制備，平行制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進樣分析，計算得出五味子醇甲含量SRSD為0.89%，說明該方法重復性良好。

1.3.1.2.5 加樣回收率考察

精密吸取6份10 mL含量相同的供試品，精密加入10 mL五味子醇甲對照品，混合均勻，注入液相色譜儀進樣分析，SRSD為0.55%。

1.3.2 響應面法優化五味子醇甲提取工藝

1.3.2.1 五味子醇甲的提取

將五味子粉碎過篩，加入一定量的β-環糊精，與一定量的溶劑混勻，超聲提取，提取液過濾。

1.3.2.2 單因素試驗

通過查閱文獻[6]，并進行預試驗考察，選取乙醇體積分數、β-環糊精加入量、提取時間3個因素作為自變量，五味子醇甲提取率作為因變量。各因素的水平梯度設置：乙醇體積分數為40%，60%，80%和100%；β-環糊精加入量為0，10%，15%和20%；提取時間為10，20，30，40和50 min。根據試驗結果選出主要影響因素，根據響應面法設計五味子醇甲提取工藝，建立最優工藝。

1.3.2.3 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗考察基礎上，依據各因素對五味子醇甲提取率的影響，選取適當的自變量，以五味子醇甲提取率為評價指標，采用Design Expert試驗設計軟件進行試驗，依據試驗結果擬合二次多項式方程，并建立響應面模型，預測最佳五味子醇甲提取工藝及五味子醇甲提取率。試驗因素及各水平見表1。

表1 五味子提取工藝響應面試驗因素與水平

1.3.2.4 最優處方驗證

根據Design Expert軟件所給出的最優提取工藝預測各因素的最優值，計算五味子醇甲提取率，與軟件所給出的預測值對比，驗證軟件的準確性。

2 結果與分析

2.1 HPLC色譜圖

五味子醇甲對照品、五味子醇甲樣品色譜圖，見圖1。由圖1（a）可知，五味子醇甲在保留時間8.234 min出現色譜峰。由圖1（b）可知，樣品中含有五味子醇甲，且在保留時間8.363 min出現色譜峰。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對五味子醇甲提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數增大，五味子醇甲提取率增大，乙醇體積分數80%，五味子醇甲提取率達到最大。乙醇體積分數繼續增加，五味子醇甲提取率反而減少。因此，選擇80%乙醇作為響應面中心點。

圖2 乙醇體積分數對五味子醇甲提取率的影響

2.2.2β-環糊精加入量對五味子醇甲提取率的影響

由圖3可知，隨著β-環糊精加入量的增加，五味子醇甲提取率增加，當β-環糊精加入量為10%時，五味子醇甲提取率達到最大，繼續增加β-環糊精的質量，五味子醇甲提取率反而降低。因此選擇10%β-環糊精加入量為中心點。

圖3 β-環糊精加入量對五味子醇甲提取率的影響

2.2.3 提取時長對五味子醇甲提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間延長，五味子醇甲提取率增加，當提取時間達到30 min時，五味子醇甲提取率保持穩定。故選擇30 min作為響應面提取時間中心點。

圖4 提取時間對五味子醇甲提取率的影響

2.3 五味子醇甲的提取工藝優化

2.3.1 響應面設計結果

運用Design-Expert 8.0.6對表2中試驗結果進行多元線性回歸及二項式擬合，得到二項式擬合方程：Y=0.68-0.021A+0.021B+0.014C-0.014AB-0.012AC-8.672×10-3BC-0.027A2-0.019B2-2.468×10-3C2。

表2 提取工藝試驗設計及結果

由表3可知：該模型P=0.015 7＜0.01，表明模型顯著；失擬項P＞0.05，表明模型擬合度良好。由方差分析可知，自變量1次項A、B以及二次項A2顯著（P＜0.05），表明該模型具有統計學意義。

表3 提取工藝方差分析

固定三個變量之一為中值，繪制提取率的效應曲面圖。由圖5可知，與C方向比較，B效應面更陡，說明β-環糊精對五味子醇甲提取率的影響要大于提取時間。各因素的交互作用，由圖5~圖7等高線的形狀及響應曲線的陡峭程度可以得出，各因素的相互作用不顯著。

圖5 β-環糊精加入量與提取時間對五味子醇甲提取率影響的等高線圖與響應曲面圖

圖6 乙醇體積分數與提取時間對五味子醇甲提取率影響的等高線圖與響應曲面圖

圖7 乙醇體積分數與β-環糊精加入量對五味子醇甲提取率影響的等高線圖與響應面圖

2.3.2 提取工藝條件優化預測

運用Design-Expert 8.0.6軟件優化所得的五味子醇甲最優提取工藝為乙醇體積分數72.40%、β-環糊精含量12.98%、提取時間40.00 min，五味子醇甲提取率為0.71%。

2.4 驗證試驗

依據響應面優化的最佳條件進行驗證試驗，在其他因素固定不變的條件下，按照最優提取工藝預測：乙醇體積分數72.40%、β-環糊精含量12.98%、提取時間40.00 min，五味子醇甲提取率為0.689%，0.701%和0.698%（n=3），SRSD值分別為0.25%，0.37%和0.46%，表明該驗證試驗的結果可靠、準確。

3 結論

試驗以乙醇體積分數、超聲時間、β-環糊精加入量為考察因素，以五味子醇甲提取率為評價指標，采用Box-Behnken設計-效應面法對提取條件優化，建立多元線性模型，并繪制效應面圖，得到最優提取條件。驗證五味子醇甲最優提取條件，試驗數據表明，最優提取條件能明顯提高五味子醇甲提取率。此次試驗為五味子醇甲提取率相關影響因素的探究提供理論依據和工藝參考。