玉米低聚肽制備條件優化

李秋紅，夏穎穎，崔強, ，孫學謙, ，李樹，夏尚磊,

1.山東西王糖業有限公司技術中心（鄒平 256209）；2.山東省玉米生物加工循環經濟工程技術研究中心（鄒平 256209）；3.山東大學海洋學院（威海 264209）

玉米低聚肽粉是以玉米蛋白為原料，用酶（蛋白酶）解法生產，以相對分子質量小于1 000的低聚肽為主要成分的粉末狀產品。玉米低聚肽營養豐富，有易吸收、易溶解、熱穩定、天然安全等優點，被廣泛應用于食品[1]、保健品[2]、工業制造、煙草制品、化妝品、飼料[3]、醫藥[4-5]等領域。國外對肽類的研究較多，早在20世紀40年代就已出現有關肽類應用的研究報道[7-9]。在國內，玉米低聚肽的研究起步較晚，但是發展迅速[10-13]。隨著基因組研究工作深入發展，玉米肽的研制及開發生產成為各大領域新興產業的發展方向。國內外玉米低聚肽研究均以烘干后的蛋白粉為原料，經過高溫烘干后的蛋白粉用蛋白酶水解后，水解度較低。為提高蛋白水解度并實現蛋白在玉米淀粉生產線上完成水解的目的，試驗以玉米濕蛋白為原料，采用適合生產條件的酸性蛋白酶，對影響蛋白酶作用的因素進行研究優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米濕蛋白（山東西王糖業有限公司）；酸性蛋白酶（118 000 U/mL，百斯杰生物工程有限公司）；HCl、NaOH（山東宏川化工有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

JOAN 1 mL移液槍（杭州天裕化工儀器）；PHB-3 pH計（上海三信儀表廠）；WAY-ZT阿貝折光儀（上海精科儀器廠）；BSA224S分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；DK-98-Ⅰ四孔電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；JJ-1定時電動攪拌器（江蘇市中大儀器廠）；J-E離心機（美國貝克曼）；KDY-04C定氮儀（北京金北德工貿有限公司）；GX-05A高速萬能粉碎機（上海隆拓儀器設備有限公司）；60目（約0.250 mm）不銹鋼篩（新鄉市千振機械有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米濕蛋白前處理

取淀粉廠過濾板框工段玉米濕蛋白濾餅，用高速萬能粉碎機粉碎，過0.250 mm（60目）篩，篩下物備用。

1.3.2 水解度（DH）的計算[14]

式中：N0為反應前玉米蛋白液中可溶性蛋白含量，%；N1為酶解后酶解液中可溶性蛋白含量，%；N2為玉米濕蛋白中總蛋白含量，%。蛋白含量用定氮儀檢測。

1.3.3 底物濃度對DH的影響

玉米濕蛋白和純水按一定比例添加，配制干基底物濃度分別為5%，10%，15%和20%的溶液，pH 3.8（玉米濕蛋白加水后pH，未調節），加酶量10%（干基質量），反應溫度50 ℃，攪拌，反應周期24 h。水解結束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.4 反應pH對DH的影響

玉米濕蛋白干基質量濃度10%，pH分別調節為3.5，3.8，4.0和4.5，加酶量10%（干基質量），反應溫度50 ℃，攪拌，反應周期24 h。水解結束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.5 蛋白酶加酶量對DH的影響

玉米濕蛋白干基質量濃度10%，pH 3.8，加酶量分別為玉米濕蛋白干基質量的3%，5%，8%，10%，12%和15%，反應溫度50 ℃，攪拌，反應周期24 h。水解結束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.6 反應溫度對DH的影響

玉米濕蛋白干基質量濃度10%，pH 3.8，加酶量10%，反應溫度分別設置為40，45，50，55，60和65℃，攪拌，反應周期24 h。水解結束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.7 反應周期對DH的影響

玉米濕蛋白干基質量濃度10%，pH 3.8，加酶量10%，反應溫度50 ℃，攪拌，反應周期分別為6，12，18和24 h。水解結束后料液按5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.8 正交試驗

根據單因素試驗結果，底物濃度、pH、加酶量、反應溫度和反應周期選擇不同的水平，見表1，對玉米濕蛋白的水解條件進行優化。

表1 正交試驗設計L16(45)

2 結果與討論

2.1 底物濃度對DH的影響

由圖1可以看出，隨著反應底物濃度的增加，蛋白酶對玉米濕蛋白的水解度降低，可能是因為玉米濕蛋白不可溶，在反應體系中以混懸狀態存在，隨著底物濃度的增加，體系流動性較差，不利于蛋白的分散，酶與底物的接觸概率也逐漸減少，使得相同的反應周期內，底物濃度越高的體系，酶對蛋白的水解度越低[15]。雖然底物濃度低有利于提高酶對蛋白的水解度，但是底物濃度高，單位時間內處理的原料越多，產品收率高，有利于產能的增加，經濟效益就越高。綜合考慮經濟效益和酶的水解效率，最終選定的合適的底物濃度為10%。

圖1 底物濃度對DH的影響

2.2 反應pH對DH的影響

由圖2可以看出，pH在3.5~3.8范圍內，隨著pH的升高，蛋白酶對蛋白的水解程度增加，pH 3.8左右時，蛋白酶對玉米濕蛋白的水解效率最好，水解度可達50.6%。但是pH高于3.8時，隨著pH的升高，酶的水解效率降低，說明pH與酶的活性密切相關。生產過程中的玉米濕蛋白混懸液pH一般在3.5~4.0之間，所以為了完成玉米蛋白的在線分解，使得酶適應玉米蛋白生產線，酶解過程采用酸性蛋白酶，過程中可以不用調節pH，既可節約輔料投入成本，又能減少后續凈化工序的負擔。

圖2 pH對DH的影響

2.3 蛋白酶加酶量對DH的影響

由圖3可以看出，反應底物濃度10%時，隨著加酶量的增加，單位物料接觸到的蛋白酶越多，對蛋白的水解速度和效率增加，所以加酶量越高，玉米蛋白的水解程度越高。但是蛋白酶的售價普遍較高，加酶量增加，意味著酶投入成本增加。綜合考慮酶成本與水解度，最終選定的玉米蛋白水解的加酶量為10%，此時水解度可達51.6%。

圖3 加酶量對DH的影響

2.4 反應溫度對DH的影響

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，酶的運動速度增加，與蛋白接觸的概率增加，玉米蛋白的水解度增加，反應溫度50 ℃時水解度達到最高53.6%。反應溫度45~50 ℃時水解度變化不大，但是溫度繼續升高時，維持溫度所需的能耗增加，并且酸性蛋白酶的酶活失效加快，玉米濕蛋白的水解度反而降低。所以確定玉米蛋白的水解溫度50 ℃為宜。

圖4 反應溫度對DH的影響

2.5 反應周期對DH的影響

由圖5可以看出，反應周期越長，蛋白酶對蛋白分子的作用時間越長，玉米濕蛋白的水解程度越高，說明酸性蛋白酶對玉米蛋白的水解效率比較低下，需要靠反應時間的延長增加水解度。但是反應周期的延長會增加相應的能耗。綜合考慮節能降耗和蛋白水解度，最終確定的反應周期為24 h。

圖5 反應周期對DH的影響

2.6 正交試驗結果

由表2可以看出，各個因素對水解度的影響從大到小：加酶量＞底物濃度＞反應周期＞反應溫度＞反應pH，最優組合為加酶量10%，底物濃度6%，反應周期28 h，反應pH 3.6，反應溫度50 ℃。

表2 正交試驗結果

2.7 正交試驗結果驗證

驗證試驗共進行3次，以正交試驗最優組合為反應條件，對玉米濕蛋白進行水解反應，最終水解度分別為72.29%，72.24%和72.30%，均高于正交試驗最高結果71.12%，說明經過試驗研究得到的最優水解條件結果可靠。

3 結論

以玉米濕蛋白為原料，采用酸性蛋白酶進行水解，最優的水解條件為加酶量10%，底物濃度6%，反應周期28 h，反應pH 3.6，反應溫度50 ℃。此條件下得到的蛋白水解液干物濃度12.5%，水解液中蛋白含量60.72%，玉米濕蛋白水解度72.30%。水解液脫苦、脫色后[16]，可溶性蛋白提純、冷凍干燥[17-19]，可得到玉米低聚肽產品。