果酒的釀造工藝

方穗戀 ，郭琳苑，黃心洳，呂樺欣，賈寶珠

1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（廣州 510303）；2.廣州金至檢測技術(shù)有限公司（廣州 510300）

香蕉是典型的熱帶作物，產(chǎn)量位居世界前四[1]。香蕉富含淀粉、果膠、VB、VC、VE、Ca、P等營養(yǎng)成分[2]，還含有多酚、黃酮等多種活性物質(zhì)[3]，具有抗抑郁、降血糖、抗氧化等多種功效[4]。香蕉是一種躍變型水果，保鮮期短，易腐敗變質(zhì)[5]，每年由于貯存和運(yùn)輸造成的損失達(dá)30%~50%[6]。在香蕉種植地對其進(jìn)行加工利用，既能降低貯存和運(yùn)輸過程中造成的不必要損失，又可以增加香蕉的商業(yè)價(jià)值。葡萄中含有多種維生素及礦物質(zhì)，還含有多種人體所需的氨基酸[7]。研究表明，葡萄具有助消化、健脾胃、防癌、緩解衰老、美容等多種功效[8-9]。在我國，葡萄主要以鮮食為主，而葡萄產(chǎn)量高，運(yùn)輸保鮮等技術(shù)落后，容易積壓和滯銷[10]。

試驗(yàn)以香蕉、葡萄為原料，開發(fā)一款功能性的復(fù)合果酒。采用響應(yīng)面法對香蕉葡萄復(fù)合果酒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的釀造工藝條件，為香蕉和葡萄的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄、香蕉、白砂糖（市售）；SY葡萄酒·果酒專用酵母（安琪酵母股份有限公司）；植物水解酶（諾維信生物技術(shù)有限公司）；抗壞血酸、檸檬酸（食品級，廣州齊云生物技術(shù)有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥97%，美倫生物技術(shù)有限公司）；硝酸鋁、亞硝酸鈉（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；氫氧化鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；水楊酸、硫酸亞鐵、無水三氯化鐵、無水乙醇、鐵氰化鉀（均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；三氯乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；95%乙醇（分析純，北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；0~25%vol酒精濃度計(jì)（博衡儀器儀表有限公司）；LB32T型糖度計(jì)（廣州市速為電子科技有限公司）；752N紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 香蕉葡萄復(fù)合果酒生產(chǎn)工藝流程

原料預(yù)處理→酶解→接種→主發(fā)酵→復(fù)發(fā)酵→殺菌→成品

原料預(yù)處理：香蕉剝皮后，與純凈水按1∶1比例打漿，添加0.15%檸檬酸和0.10%抗壞血酸進(jìn)行護(hù)色；將清洗干凈的葡萄進(jìn)行打漿。香蕉漿與葡萄漿按2∶1比例調(diào)漿。

酶解：調(diào)節(jié)混合果漿pH至4.0~4.5，加入一定量植物水解酶，40~45 ℃下酶解100~120 min。

接種：稱取適量的活性干酵母溶于5%蔗糖溶液，30~40 ℃下水浴活化20~30 min。調(diào)節(jié)混合果漿的糖度，加入一定量已活化的酵母。

主發(fā)酵：混合果漿于28 ℃發(fā)酵7 d。

復(fù)發(fā)酵：離心、抽濾后，18~24 ℃下利用殘?zhí)抢^續(xù)發(fā)酵30 d。

殺菌：65~70 ℃的水浴下殺菌15~25 min，使酵母失活。

1.3.2 香蕉葡萄復(fù)合果酒工藝優(yōu)化

1.3.2.1 香蕉葡萄復(fù)合果酒單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取酶添加量、酵母添加量、初始糖度為考慮因素，于主發(fā)酵后，以4 000 r/min離心5 min，抽濾得到澄清初始果酒，選取酶添加量（0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%）、酵母添加量（0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%和0.14%）、初始糖度（14.0%，16.0%，18.0%，20.0%，22.0%和24.0%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測定總黃酮濃度、糖度及酒精度，確定最佳工藝條件。

1.3.2.2 香蕉葡萄復(fù)合果酒響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酶添加量（A）、酵母添加量（B）、初始糖度（C）為考慮因素，香蕉葡萄復(fù)合果酒主發(fā)酵后總黃酮濃度（Y）為評價(jià)指標(biāo)，使用Design-Expert 11.1.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 單位：%

1.3.3 香蕉葡萄復(fù)合果酒質(zhì)量評定

1.3.3.1 理化指標(biāo)測定

1.3.3.1.1 總黃酮濃度的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[11]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.984 6X+0.002 6，R2=0.999 5，以此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總黃酮濃度。

1.3.3.1.2 糖度測定

手持糖度計(jì)法。

1.3.3.1.3 酒精度測定

酒精計(jì)法。

1.3.3.2 抗氧化性測定

1.3.3.2.1 羥自由基（·OH）的清除能力測定[12]

利用Fenton反應(yīng)[13]生成羥自由基，測定香蕉葡萄復(fù)合果酒對羥自由基的清除率。取1 mL 9 mmol/mL硫酸亞鐵溶液、2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和2 mL不同濃度待測果酒，加入1 mL 8.8 mol/L過氧化氫溶液，充分混合，在37 ℃孵育30 min，以5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，以VC為對照，在510 nm處測量吸光度。由于樣液本身具有吸光度，測其本底值時(shí)用蒸餾水代替過氧化氫，根據(jù)式（1）計(jì)算清除率。

式中：A0是空白對照液吸光度，用蒸餾水代替樣品液；A1是該樣品吸光度；A2是色素溶液本身的吸光度，用蒸餾水代替反應(yīng)試劑。

1.3.3.2.2 鐵還原能力測定[14]

分別吸取2.5 mL不同質(zhì)量濃度的果酒，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液、2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液，充分混勻，在50 ℃水浴20 min后加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，充分混合，在3 000 r/min下離心10 min，吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L三氯化鐵溶液，充分混勻，以蒸餾水為空白，以VC為對照，在700 nm波長處測定其吸光度以表示鐵還原能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對總黃酮濃度的影響

由圖1可知，復(fù)合果酒的總黃酮濃度隨著酶添加量的增加呈先上升后下降趨勢。酶添加量0.08%時(shí)，主發(fā)酵后，果酒總黃酮濃度為8.42 mg/100 mL，風(fēng)味口感良好。

圖1 酶添加量對復(fù)合果酒總黃酮濃度的影響（n=2）

2.1.2 酵母添加量對總黃酮濃度的影響

由圖2可知，復(fù)合果酒的總黃酮濃度隨著酵母添加量的增加呈先上升后下降趨勢。酵母添加量0.06%時(shí)，主發(fā)酵后，果酒總黃酮濃度為7.52 mg/100 mL，風(fēng)味口感良好。

圖2 酵母添加量對復(fù)合果酒總黃酮濃度的影響（n=2）

2.1.3 初始糖度對總黃酮濃度的影響

由圖3可知，復(fù)合果酒的總黃酮濃度隨著初始糖度的增加呈先上升后下降趨勢。初始糖度較低，無法滿足酵母菌的需要，不益于果酒發(fā)酵；初始糖度過高，發(fā)酵液滲透壓升高，酵母菌活性降低，抑制酵母菌生長繁殖和產(chǎn)酒精。初始糖度20.0%時(shí)，主發(fā)酵后，果酒總黃酮濃度為5.21 mg/100 mL，風(fēng)味口感良好。

圖3 初始糖度對復(fù)合果酒總黃酮濃度的影響（n=2）

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性分析

通過響應(yīng)面法對酶添加量、酵母添加量、初始糖度3個因素進(jìn)行分析，如表2所示。應(yīng)用Design-Expert軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多回歸擬合分析，獲得多元二次回歸方程：Y=7.20+0.33A+0.258 8B+0.531 13C+0.245 0AB+0.4AC+0.127 5BC-4 208A2-0.748 3B2-0.588 2C2。異極顯著。通過比較F值的大小可知各釀造工藝因素對復(fù)合果酒的影響大小：初始糖度（C）＞酶添加量（A）＞酵母添加量（B）。

2.2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素的交互影響

由圖4~圖6可知，酶添加量與初始糖度交互作用顯著，總黃酮濃度的極大點(diǎn)出現(xiàn)在酶添加量0.10%、初始糖度22.0%；酶添加量與酵母添加量交互作用顯著，總黃酮濃度的極大點(diǎn)出現(xiàn)在較高酶添加量0.09%~0.10%，酵母添加量0.06%~0.07%；酵母添加量與初始糖度交互作用顯著，總黃酮濃度的極大點(diǎn)出現(xiàn)在酵母添加量范圍0.06%~0.07%，初始糖度21.0%~22.0%。

圖4 酶添加量與初始糖度對總黃酮濃度的交互影響

圖5 酶添加量與酵母添加量對總黃酮濃度的交互影響

圖6 酵母添加量與初始糖度對總黃酮濃度的交互影響

通過Design-Expert 11.1.0求解回歸方程，得到最佳的理論工藝條件：酶添加量0.097 6%、酵母添加量0.067 6%、初始糖度21.6%，此條件下果酒的總黃酮濃度為7.611 6 mg/100 mL。考慮到實(shí)踐操作的情況，將最佳工藝條件修正為酶添加量0.10%、酵母添加量0.07%、初始糖度21.6%，得到的果酒總黃酮濃度為7.42 mg/100 mL（n=3），與理論預(yù)測值基本吻合，說明通過該模型分析得到的最佳釀造工藝條件可靠。

2.3 香蕉葡萄復(fù)合果酒的抗氧化性分析

由圖7~圖8可知，隨著濃度的不斷增大，果酒對·OH清除能力及鐵還原能力都在不斷增強(qiáng)，表明香蕉葡萄復(fù)合果酒具有良好的抗氧化和·OH自由基清除能力。

圖7 ·OH清除能力對比圖（n=3）

圖8 鐵還原能力對比圖（n=3）

2.4 理化分析

對復(fù)合果酒糖度、酒精度與總黃酮濃度等理化指標(biāo)進(jìn)行了測定，如表3所示。此次研究制成的果酒口感清甜、醇厚留香，理化指標(biāo)符合果酒相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 復(fù)合果酒理化指標(biāo)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法對香蕉葡萄復(fù)合果酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對釀造后的香蕉葡萄復(fù)合果酒進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。復(fù)合果酒的最佳釀造工藝條件為酶添加量0.10%、酵母添加量0.07%，初始糖度21.6%。在此釀造條件下，復(fù)合果酒的總黃酮濃度為7.42 mg/100 mL，糖度為5.4%，酒精度為16.7%vol，果酒澄清透明、果香濃郁、清爽醇厚，具有良好的抗氧化能力和·OH清除能力。