PEX 基因轉染人臍帶間充質干細胞的體外培養及鑒定

謝 炯，戚 繼

（北京豐臺醫院神經外科，北京 100000）

膠質瘤（glioma）是神經系統發病率最高、預后不佳的原發性腦腫瘤，膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是膠質瘤中惡性程度最高的一種，即使采用手術及同步放化療的標準治療方法，患者的一般生存期僅為14.4 個月左右[1]。因血腦屏障的存在，很多藥物無法準確到達腫瘤病灶，但具有跨血腦屏障特性的人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HuMSCs）可以作為細胞載體有效地將所需藥物及目的基因送到靶向部位[2]，進而提高膠質瘤的治療效果。PEX 基因能夠干預惡性膠質瘤的侵襲行為，在膠質瘤基因治療中具有很好的臨床應用前景。本研究主要探討PEX 基因修飾HuMSCs 的可行性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HuMSCs（天津和澤生物科技有限責任公司提供），U87 膠質瘤細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心），DMEM/F-12 培養基（美國GIBCO 公司），FBS（以色列BI 公司），胰蛋白酶（美國AMRESCO 公司），EDTA（美國Sigma 公司），青/鏈霉素霉素溶液（Solarvio 公司），質粒pcDNA3.1（+）（Invitrogen），JM109 高效率感受態細胞、pGEM?-T Easy 載體、RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、小提質粒試劑盒、G418、轉染試劑FuGENE?HD、HEPES（Promega 公司），Xho Ⅰ、BamHⅠ、T4 DNA 連接試劑盒（日本TaKaRa 公司），Universal DNA Purifieation Kit DNA 純化回收試劑盒、大提質粒試劑盒（北京艾德萊公司），FITC 標記小鼠抗大鼠CD19、CD34、CD90、CD45、CD105 單克隆抗體（BD Biosciences 公司），引物由Invitrogen 公司合成，其它常規試劑為進口分裝或國產分析純。

1.2 HuMSCs 培養鑒定與U87 膠質瘤細胞培養 將HuMSCs 和U87 細胞分別接種于面積為75 cm2的細胞培養瓶中，加入10%胎牛血清的DMEM 培養基，置入37 ℃，5% CO2培養箱中培養，每48 h 換一次培養基。當有約90%左右的細胞貼壁生長時傳代培養，傳代時向培養瓶中加入0.25%的胰蛋白酶消化1.5 min 后棄去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養液終止消化，吹打沖洗成細胞懸液，將細胞懸液置入15 ml 離心管中于室溫下，1500 rpm/min離心5 min；棄去上清液，加入2 ml 全培養反復吹打沖洗成細胞懸液。以1∶3 傳代接種到75 cm2的細胞培養瓶中，后項培養瓶中加入全培養基約至10 ml，置入37 ℃，5% CO2培養箱中培養。取傳代至第3 代HuMSCs，待細胞長滿80%～90%時，應用流式細胞儀檢測細胞CD11b、CD19、CD34、CD73、CD90、CD45、CD105 表面抗原的表達。

1.3 PEX 真核表達載體構建與鑒定 參照GenBank中MMP-2 堿基序列（NM-031054），設計PEX 正反引物：正向引：5'-CCGCTCGAGAGATCTGCAAGCAAGACAT-3'，反向引物：5'-CGGGATCCGCAGCCCAGCCAGTCCGATT-3'，產物為582 bp。分別加入XhoⅠ、BamHⅠ酶切位點（引物中劃線部分）。采用Promega 公司的RNA 提取試劑盒從U87 膠質瘤細胞中提取總RAN，按RT-PCR 試劑盒操作步驟擴增目的基因，退火溫度為60 ℃，PCR 產物經純化回收后，與單克隆pGEM?-T Easy 載體連接，轉化JM109 高效率感受態細胞，經LB/Amp 培養基和藍白（IPTG/X-Gal）篩選挑取陽性克隆進行細菌培養。以菌液為模板，按RT-PCR 體外獲取擴增PEX 基因。目的基因與質粒載體分別采用XhoⅠ、BamHⅠ進行雙酶切，酶切后膠回收獲得載體片段和目的基因片段，然后連接、轉化，小抽質粒，酶切鑒定，并送菌液測序。

1.4 重組質粒轉染HuMSCs 將對數生長期的第3 代HuMSCs 接種于24 孔培養板，37 ℃、5% CO2細胞培箱中培養。當細胞融合約80%時，用轉染試劑Fu－GENE?HD 和重組質粒轉染HuMSCs 細胞，具體步驟按照FuGENE?HD 轉染步驟操作。設立未轉染組、空載體轉染作為對照。轉染48 h 后，采用G418篩選（400 ng/μl），10 d 后以200 ng/μl 篩選，4 周后將篩選出的細胞培養擴增。以β-actin 為內參，RTPCR 法檢測轉染組和對照組PEX 基因表達表達的差異性。設計GAPDH 正反引物：正向引物：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；反向引物：AGGGGCCATCCACAGTCTTC；產物為258 bp。

2 結果

2.1 HuMSCs 的培養及鑒定 原代培養的HuMSCs 細胞呈長條狀或長梭狀，細胞隨著培養時間的增加逐漸變長變大并貼壁完全，形態學變為扁平狀，于傳代后第5 天左右即可完全融合，呈放射狀或者螺旋狀生長（圖1）。

圖1 HuMSCs 細胞生長形態（螺旋狀、發散型生長）（×40）

通過流式細胞學技術分別檢測P5 代HuCMSCs，表面分子標志物結果顯示各代均表達間充質干細胞標志CD73、CD90 和CD105，而不表達造血干細胞標志CD11b、CD19、CD34、CD45 和組織相容抗原HLA-DR，見圖2。

圖2 原代培養的HuMSCs 流式細胞儀檢測結果

2.2 目的基因培養及重組質粒載體構建 RT-PCR 檢測顯示，目的基因PEX 位于DNA Maker 500～750 bp 的特異性條帶（圖3），說明成功培養PEX；同時，抽提質粒后雙酶切鑒定顯示，重組質粒PEX-pcDNA3.1（+）位于DNA Maker 5000 bp 的特異性條帶，且重組質粒PEX-pcDNA3.1（+）雙酶切后位于DNA Maker 500～750 bp 和5000 bp 兩條特異性條帶（圖4），說明重組質粒構建成功，且成功轉染HuMSCs；留取菌液測序，結果證實證實質粒載體PEX-pcDNA3.1（+）構建成功，見圖5。

圖3 目的基因PEX 的擴增

圖4 抽提質粒后雙酶切鑒定

圖5 測序驗證結果

2.3 重組質粒PEX-pcDNA3.1（+）表達情況 RTPCR 檢測驗證了重組質粒PEX-pcDNA3.1（+）成功轉染HuMSCs，且在HuMSCs 中高表達。重組質粒轉染HuMSCs 及經G418 篩選獲得穩定表達PEX 基因的HuMSCs，其于紫外燈下可見分別位于DNA Maker 250～500 bp 和500～700 bp 產生兩條特異性條帶，與預期的GAPDH 及PEX 產物片段大小相符。轉染組和對照組細胞的GAPDH 產物亮度相仿，而轉染組細胞PEX 產物亮度較對照組明顯增強（圖6）。以G418 篩選（400 ng/μl），10 d 后以200 ng/μl 篩選，4 周后篩選出的細胞可穩定生長。

圖6 RT-PCR 檢測轉染組和對照組HuMSCs 中PEX 基因的表達

3 討論

研究發現[3，4]，幾乎所有MMPs 在其羧基末端均含有1 個血紅素結合蛋白樣結構域，通過C 端和αvβ3 關聯，激活其催化活性，產生C 端類血紅素結合片斷PEX。PEX 可抑制膠質瘤細胞、內皮細胞與成纖維細胞生長因2（FGF-2）、整合素αvβ3 以及玻連蛋白等的粘附，從而起到抑制膠質瘤和內皮細胞的遷移，進而達到抑制膠質瘤的生長和復發。有研究表明[5]，PEX 對體外培養的膠質瘤干細胞增殖有顯著抑制作用。因此，PEX 在針對人腦膠質瘤侵襲性的治療上具有很好的臨床應用價值，但如何使PEX基因精確且有效的發揮抑瘤作用值得臨床進一步研究和探索。

基因療法作為治療膠質瘤的一種新方式，如何尋找一種特異而有效性的靶向腫瘤細胞的載體，且可攜帶抗癌基因來跟蹤并有效抑制腫瘤細胞有待探索。研究發現[6-8]，MSC 本身具有易于體外擴增、強大的遷移能力和趨瘤性、低免疫原性和免疫調節作用，因此移植細胞的免疫排斥輕微，從而極大地降低了移植風險，其作為靶細胞基因載體在治療疾病中的作用越來越重要，并已成為最具臨床前景的細胞治療產品。Deng L 等[9]研究發現，TRAIL 的基因修飾MSCs 有抑制膠質瘤生長的特性。羅曉紅等[10]成功構建了攜帶HGF 基因的BMSC，不僅可以穩定表達并可增強MSCs 增殖及遷移能力。李千會等[11]驗證了VEGF 可穩定轉染BMSCs 內并可穩定表達發揮作用。

BMSCs 雖然具有高度增殖能力及多向分化潛能，但在實際應用中，BMSCs 含量易受年齡因素影響，對供者有一定的創傷性，加之BMSCs 分離純化的難度增加、病毒感染率高，限制了其在臨床的應用。相比之下，HuMSCs 的來源廣泛、成本低、取材方便、培養成功率較高、增殖能力強，并具有免疫原性低、免疫調節特性強的特點，使其成為一種潛在的、可大規模生產的神經損傷“修復劑”及神經炎癥“調節劑”[12-14]。崔連旭等[15]研究驗證了HuMSCs 有減少神經元細胞凋亡的作用。另外，HuMSCs 還具有多向分化、旁分泌、免疫調節、定向遷移、基因穩定易于轉染等優勢，不易引起宿主對移植細胞的免疫排斥反應等優點[16，17]。因此，HuMSCs 具有更大的應用潛能，可能成為BMSCs 的理想替代物，越來越受到臨床關注[18]。

另有研究發現[19，20]，HuMSCs 也具有抑制腫瘤生長、選擇性遷移到損傷組織的歸巢能力，并可以通過釋放有益的細胞因子促進自身組織的再生。已有學者研究PEX 基因修飾間充質干細胞治療腫瘤研究[21-23]，結果發現PEX 不僅可以阻止膠質瘤細胞和內皮細胞的遷移，同時可以誘導內皮細胞的凋亡，進而抑制膠質瘤細胞和血管的增殖以及轉移。因而，本研究擬構建攜帶抗瘤基因PEX 的HuMSCs 細胞載體，利用其不間斷地表達、釋放可溶性的抗瘤分子來治療腫瘤，進而發揮抑制腫瘤生長，提高膠質瘤患者的生存周期。最終，本研究成功構建了PEXpcDNA3.1（+）真核表達載體，并將PEX 基因高效導入靶細胞，成功分泌出PEX 蛋白，使其不僅具有PEX 抗腫瘤血管形成、誘導凋亡和抑制腫瘤生長的作用，又兼有HuMSCs 示蹤腫瘤的多重特性，為其在惡性膠質瘤的基因治療開辟了一條新途徑。該體系的構建為更深入地研究PEX 基因及HuMSCs 的作用提供了實驗基礎，為后續膠質瘤的靶向治療提供了科學依據。

綜上所述，本研究構建的PEX-pcDNA3.1（+）真核表達載體可用于轉染HuMSCs，為進一步探討其在膠質瘤治療中的作用奠定了基礎。