漢黃芩素抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的研究

林彩星，陳 罡，楊振東，蔣偉哲，言柯柯，伍小薇，韋祝新

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院放療科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是來源于鼻咽部被覆上皮的惡性腫瘤，其發病具有明顯的地區聚集性，在我國以廣東、廣西、香港等為鼻咽癌高發地區[1]。據最新發布的全球癌癥統計報告，鼻咽癌2020 年新發病例約為13.3 萬，占全部新診斷腫瘤的0.7%，其中死亡病例約為8 萬（占0.8%）[2]。目前認為，鼻咽癌的發生與遺傳易感性、EB 病毒感染、環境因素等相關[3]。隨著放療技術和綜合治療的不斷發展，Ⅰ期鼻咽癌5 年生存率可達95%以上，但是鼻咽癌的復發和轉移仍然是患者治療失敗的主要原因。放療是鼻咽癌患者最主要的治療方式，但是對于一些晚期患者需行聯合治療方可提高治療療效。中藥治療配合放化療可減輕放化療所引起的副作用，但中藥對腫瘤的直接殺滅作用尚未得到充分驗證。漢黃芩素是傳統中草藥黃芩的有效成分之一，具有消炎、抗病毒、抗氧化、抗癌和神經保護等多種藥理作用[4-7]，且在多種腫瘤中顯示出強大的抗腫瘤作用，如胰腺癌[8-10]、結腸癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]、肺癌[14]以及卵巢癌[15]等。有報道稱[16]，漢黃芩素可抑制鼻咽癌CNE2 細胞增殖并誘導其凋亡，但其對鼻咽癌細胞遷移和侵襲作用尚未明確。基于此，本研究擬在2株鼻咽癌細胞株C666-1、HK-1 中研究漢黃芩素對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的作用，進一步了解漢黃芩素對鼻咽癌細胞的影響，以期為開發新型抗腫瘤藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人C666-1、HK-1 均來源于廣西醫科大學耳鼻喉實驗室。RPMI-1640、0.25%胰酶購于美國Gibco 公司，胎牛血清購于依科賽生物公司，CCK8試劑盒購于中國白鯊公司，Transwell 細胞小室購于康寧公司，Matrigel 基質膠購于美國BD 公司，漢黃芩素購于成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 細胞培養和藥物處理 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基培養細胞，細胞融合率達到85%～95%時使用胰酶進行消化傳代，細胞培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中。稱取20 mg 漢黃芩素粉末，漢黃芩素分子質量為284.27，溶于0.70356 ml DMSO 溶液中配置成濃度為100 mmol/L 母液，置于-20 ℃中貯存，使用時再用培養基稀釋成不同濃度的漢黃芩素工作液。

1.3 CCK8 實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細胞的抑制作用 取處于對數生長期的鼻咽癌細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，每孔100 μl 細胞懸液種植4000 個細胞于96 孔板中，每組設置5 個重復孔。在細胞周圍放入100 μl PBS 以防止揮發。在培養箱分別培養24 h 后，以換液的形式加入含有不同濃度藥液的培養基，分別設置5 個組：0、10、20、40、80 μmol/L。隨后置于培養箱中繼續分別培養24、48 h 后取出細胞，使用PBS 緩沖液沖洗細胞2 遍，隨后以換液的形式加入100 μl CCK8 工作液（CCK8試劑∶基礎培養基=1∶9）。再將細胞避光孵育于培養箱中1.5 h 左右，隨后使用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度（OD 值）。細胞相對活性=[OD（加藥）-OD（空白）]/[OD（未加藥）-OD（空白）]×100%。實驗結果重復3 次，結果使用GraphPad Prism 8.0 軟件分析。

1.4 平板克隆實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細胞獨立生存能力的影響 使用胰酶消化細胞，6 孔板每孔大約種植500 個細胞，于培養箱中培養24 h 后，按照0、10、20、40 μmol/L 的濃度配置相應濃度的漢黃芩素工作液，分別加入細胞中，48 h 后更換完全培養基，繼續培養，每天于顯微鏡下觀察細胞集落形成情況，大約1 周后，可形成肉眼可見的細胞克隆隨后終止培養。使用4%多聚甲醛進行固定20 min，PBS 緩沖液清洗后用結晶紫染液進行染色，使用PBS 緩沖液清洗多余的染液，最后在顯微鏡下計算＞50 細胞的克隆數。

1.5 細胞劃痕實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細胞遷移能力的影響 用馬克筆在6 孔板每孔背面用直尺畫直線，每間隔約0.5 cm 畫上1 條直線，每孔畫5 條直線，以便于后期拍照。用胰酶消化細胞，6 孔板每孔大約種植50 萬個細胞，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。待細胞鋪滿6 孔板底部時，將直尺垂直于畫的直線放在6 孔板上，用1000 μl 的槍頭緊貼直尺邊緣，在每個孔的底部劃出3 條劃痕。制好劃痕后用PBS 清洗每孔5 次，并加入含有不同濃度漢黃芩素的無血清培養基，分別在0、24 h 用倒置顯微鏡在相同的位置點觀察拍照，記錄劃痕愈合的距離。用Image J 軟件測量計算各組細胞在不同時間點向劃痕愈合的相對面積。

1.6 Transwell 遷移實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細胞遷移能力的影響 用胰酶消化細胞并用不同濃度藥物溶液制備單細胞懸液。Transwell 小室的下室中加入400 μl 含20%血清的完全培養基，在上室中加入200 μl 細胞懸液，每個小室內含有10×104個細胞。將細胞放入37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。培養24 h 后用PBS 緩沖液清洗Transwell 小室3 次。用400 μl 4%多聚甲醛固定小室20 min 后用PBS 緩沖液清洗Transwell 小室3 次，然后用結晶紫染液染色20 min。染色后用PBS 緩沖液清洗每個小室3 次，隨后用醫用棉簽將上室未穿過聚碳酸酯膜的細胞擦去，注意手法要輕柔，并在室溫下晾干小室。倒置顯微鏡下對Transwell 小室進行拍照，用Image J 軟件計數各組細胞穿過小室的數量。

1.7 Transwell 侵襲實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細胞侵襲能力的影響 使用RPMI-1640 培養基將基質膠按1∶8 的比例在冰上稀釋。然后將100 μl 稀釋后的基質膠放入Transwell 上室，置于37 ℃培養箱中過夜，直至基質膠凝固。下室放入400 μl 含10%血清的RPMI-1640 培養基，上室放入200 μl 含10 萬個細胞的細胞懸液，置于培養箱中孵育36 h。隨后的細胞染色和固定步驟與Transwell 遷移實驗相同。穿膜細胞數代表各組細胞的侵襲能力。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23.0 統計學軟件對數據進行分析，用GraghPad Prism 8.0 進行繪圖分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗或F檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漢黃芩素對鼻咽癌細胞活性的影響 漢黃芩素對C666-1 和HK-1 細胞的活力均表現出明顯的抑制作用，隨藥物濃度增加，抑制效果明顯增強；同一藥物濃度下，藥物作用48 h 的抑制效果高于24 h，抑制效果表現為劑量時間依賴性（圖1）。通過GraphPad Prism 8.0 軟件計算不同時間的IC50，結果顯示漢黃芩素作用于C666-1 細胞24 h 的IC50值為37.15 μmol/L、48 h 為20.75μmol/L；漢黃芩素作用于HK-1 細胞24 h 的IC50值為29.09 μmol/L、48 h為20.46 μmol/L。

圖1 漢黃芩素對鼻咽癌細胞的抑制作用

2.2 漢黃芩素對鼻咽癌細胞增殖的影響 漢黃芩素干預后，鼻咽癌細胞C666-1 細胞形成肉眼可見集落的數目更少，體積更小，見圖2。

圖2 漢黃芩素對鼻咽癌細胞增殖的影響

2.3 漢黃芩素對鼻咽癌細胞遷移的影響 劃痕實驗結果顯示，漢黃芩素處理后，C666-1 及HK-1 細胞的遷移能力明顯受到抑制，且藥物濃度越高，抑制作用越強（圖3）。0、10、20、40 μmol/L 的漢黃芩素處理C666-1 及HK-1 細胞干預24 h 后細胞遷移面積的相對比率比較 [HK-1：（67.72±2.43）%、（45.87±2.00）%、（38.48±2.66）%、（25.98±1.23）%；C666-1：（73.07±2.30）%、（58.52±7.76）%、（43.98±2.10）%、（36.08±6.30）%]，差異有統計學意義（P＜0.05）。與劃痕實驗結果相一致，Transwell 細胞遷移實驗也表明，不同濃度漢黃芩素處理C666-1 及HK-1 細胞后，從上室遷移至下室的細胞數目明顯降低，藥物濃度越高，抑制作用越明顯（圖4）。

圖3 劃痕實驗檢測漢黃芩素對鼻咽癌細胞細胞劃痕的影響

圖4 Transwell 細胞遷移實驗檢測漢黃芩素對鼻咽癌細胞遷移能力的影響

2.4 漢黃芩素對鼻咽癌細胞侵襲的影響 漢黃芩素干預后，穿過基質膠后遷移至下室的細胞數目明顯減少，見圖5。

圖5 Transwell 侵襲實驗檢測漢黃芩素對鼻咽癌細胞侵襲能力的影響

3 討論

盡管化療和靶向藥物的應用以及放療技術的發展和進步，使得鼻咽癌患者的5 年總體生存率有了很大的提高，其中Ⅰ期鼻咽癌患者5 年生存率可達95%，Ⅱ期達85%，然而對于就診時已發生轉移的鼻咽癌患者來說，預后仍然較差，Ⅳ期鼻咽癌患者5 年生存率僅有50%。目前對于局部晚期鼻咽癌患者，在放療基礎上聯合化療是其主要的治療模式，然而化療所導致的耐藥或者患者不能耐受化療是化療失敗的主要原因，從而導致了腫瘤的進展。因此，迫切需要研發有效且毒副作用小的抗腫瘤藥物。

漢黃芩素是來源于中草藥植物中的一種純天然化合物，因其所具備的多種藥理作用而廣泛地在多種炎癥性和腫瘤性疾病中進行了研究。研究發現，漢黃芩素通過IRF3 介導的Hippo 信號通路抑制結腸癌細胞的致癌行為和EMT 過程[11]；通過抑制MMP1 表達和調控PI3K/AKT 信號通路，從而抑制肺癌細胞的生長和轉移潛能并促進細胞凋亡[14]；通過調控miRNA-135b-3p 靶向SIX4 抑制A549 細胞的侵襲轉移和EMT 過程[6]。除此之外，漢黃芩素還能通過阻滯腫瘤細胞的周期，從而發揮抑癌作用[16，17]，使細胞周期阻滯于G1/G0期[18]或G2/M 期[19]。漢黃芩素還能通過增加惡性腫瘤的放化療敏感性進一步增強其本身的抗腫瘤作用[15，20]。本研究通過CCK8 實驗證明漢黃芩素能夠有效抑制鼻咽癌細胞C666-1 和HK-1 的活性，并根據實驗結果估算出藥物的IC50，進而初步明確后續實驗研究的藥物濃度。細胞活性降低是細胞增殖受到抑制的重要原因之一，因此為進一步明確漢黃芩素對鼻咽癌細胞增殖能力的影響，通過平板克隆形成實驗來評估鼻咽癌細胞的增殖和生存能力，結果表明漢黃芩素能有效抑制C666-1 細胞的增殖和生存能力，與陳琳等[21]研究結果一致。鼻咽癌細胞的遷移以及侵襲能力的異常升高是鼻咽癌侵襲性強及易發生遠處轉移的重要原因，也是導致鼻咽癌患者預后變差的重要因素。本研究通過劃痕實驗以及Transwell 實驗發現，漢黃芩素能夠抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，漢黃芩素能抑制鼻咽癌細胞HK-1、C666-1 的活性、增殖、遷移還有侵襲能力，后續將進一步探究其在鼻咽癌細胞中的分子機制。