腰腿痛寧膠囊通過調控炎癥因子途徑對兔膝骨關節炎的影響

金美英，張偉冬，王婉霖，李泉鋒，趙文海，沙里泉*，崔鎮海*

（1.長春中醫藥大學附屬第三臨床醫院，長春 130117；2.長春中醫藥大學，長春 130017；3.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關節軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成和滑膜增生為特征的骨疾病[1]。研究[2-3]發現炎癥機制在介導生物力學失調的影響方面起著核心作用，會造成關節組織生物力學的紊亂。在KOA 炎癥的過程中，巨噬細胞會釋放出IL-1β、IL-6 和TNF-α 等細胞因子子[4]。這些細胞因子會誘導基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達，干擾細胞外基質（extracellular matrix，ECM），促使II 型膠原蛋白（collagen type II）降解，進而損傷關節軟骨，加劇KOA 的發展[5]。目前，KOA 的治療可大致分為減少誘發的危險因素、物理方式、關節內治療、手術治療和替代治療[6]。非甾體抗炎藥（NSAIDs）和對乙酰氨基酚（Paracetamol）通常被認為是治療骨關節炎的首選藥物[7]。然而非甾體抗炎藥應謹慎用于胃腸道疾病患者，有造成消化道出血、穿孔等風險[8]。因此，安全性高、副作用小的中草藥是防治骨性關節炎的較好選擇。本團隊在前期臨床試驗中已經驗證腰腿痛寧膠囊治療KOA 的確切療效。此次研究旨在觀察木瓜蛋白酶（papain）誘導的兔早期 KOA 模型中炎癥因子的水平，研究腰腿痛寧膠囊對木瓜蛋白酶誘導的兔早期 KOA 的保護作用。

1 動物與材料

1.1 動物

新西蘭大白兔20 只，體質量（2.01±0.15）kg，購于哈爾濱市道里區駿琦養殖場[生產許可證編號：SCXK（黑）2021-004]。由黑龍江省實驗動物質量監督檢驗單位檢測，實驗場地在長春中醫藥大學動物實驗中心。飼養室條件：溫度16 ～26℃，濕度40%～70%。飼養時間：上午8:30，下午3:30。實驗過程中嚴格遵守善待動物規定，最大限度減少動物的痛苦，減少動物使用數量。本實驗經過長春中醫藥大學動物倫理委員會審核批準（動物倫理審批號：2020226）。

1.2 藥物及試劑

腰腿痛寧膠囊（吉藥制備字：Z20200131000，長春中醫藥大學附屬醫院），處方成分：熟地黃、雞血藤、乳香、狗脊、薏苡仁、烏梢蛇、骨碎補、黃芪、牡蠣、鹿角霜、伸筋草、龍骨1、五靈脂、延胡索、地龍、冰片、當歸、蜈蚣、天麻、牛膝。木瓜蛋白酶（BS190-25g，Biosharp），L- 半胱氨酸（BS181-25g，Biosharp），速眠新Ⅱ[ 獸藥字（2010）070031582，圣達動物藥品有限公司]，舒泰50[（2015）外獸藥證號43 號，Virbac China]，仙靈骨葆膠囊（國藥準字：Z20025337，同濟堂制藥有限公司），ELISA 試劑盒 ：IL-1β（SP25549，Saipei Biotech Co）、IL-6（SP25495，Saipei Biotech Co）、TNF-α（SP25520，Saipei Biotech Co）。

1.3 主要儀器

動物跑步機（宇晟YS-J100），電子秤（Electronic SF-400），恒溫搖床（BLabotery ZHPW-250），染色機（DIAPATH Giotto），X 射線攝像系統（蘇州唯特銳醫療器械有限公司 VDR-1800），脫水機（DIAPATH Donatello），組織包埋中心 （Tissue-Tek TEL），正置光學顯微鏡（Nikon Eclipse E100）。

2 實驗方法

2.1 分組及模型制備

20 只實驗兔隨機分為空白組、模型組、仙靈骨葆組和腰腿痛寧組，每組5 只。模型組、仙靈骨葆組和腰腿痛寧組進行KOA 造摸。具體操作步驟：兔子保定后，剔除左膝關節局部兔毛，碘伏消毒液和75%酒精依次進行消毒，屈曲膝關節75°，定位外膝眼為進針點，誘導劑由Papain（4%）和L-Cysteine（0.03 mol·L-1）配伍，注射量0.5 mL·kg-1。在造模第1 天、第3 天、第7 天各注射1 次。同時，每日定時強迫兔在跑步機活動，早晚各1 次，每次時長為15 min，連續驅趕14 d。造模21 d 后，出現左膝關節腫脹，屈伸障礙，X 線提示膝關節結構改變，判定為KOA 模型成功。

2.2 干預方法

按照以往實驗方案進行等量換算，腰腿痛寧膠囊劑量為0.177 g·kg-1，仙靈骨葆膠囊劑量為0.099 g·kg-1。腰腿痛寧膠囊和仙靈骨葆膠囊去除膠囊外衣后，所得藥粉均用10 mL 的純凈水配成溶液，每日1 次，連續灌胃28 d。空白組和模型組無需特殊處理，常規飼養即可。

2.3 標本采集

實驗結束后，兔右后肢肌肉注射麻醉，麻醉劑（舒泰50 和速眠新Ⅱ，配比 6:1），0.35 mL·kg-1。關節腔內注入0.8 mL 無菌生理鹽水，屈伸關節15 次，抽取膝關節液 0.5 mL，耳緣靜脈處取血 5 mL，均注入無菌 EP 管中離心，設置參數為3000 r·min-1，運轉10 min，吸取上清液后置于-20 ℃ 冰箱中待測。采用空氣栓塞法進行安樂死，打開左膝關節腔，用咬骨鉗夾取股骨遠端和脛骨近端，放入4%多聚甲醛固定液中保存。

2.4 檢測指標

2.4.1 兔左膝關節活動度測量 觀察各組治療前后左膝關節活動度改變情況。在治療前（OA 模型建立后）和治療結束后，用量角器測量兔左后肢膝關節活動角度，評估關節被動活動范圍。量角器的軸心放置在膝關節的中心，量角器的靜止臂與股骨平行固定，移動臂跟蹤脛骨的運動。分別記錄膝關節處于最大伸展和屈曲狀態時的角度（°）。膝關節活動范圍的計算方法是最大伸展角度減去最大屈曲角度。

2.4.2 X 線片影像 觀察各組拍攝X 線片，觀察膝關節情況。兔置于固定器上，用眼罩遮住雙目，待到呼吸平順，被動延展兔雙后肢，保持在適度拍攝體位。正位片拍攝方法：1）兔取仰臥位，被動屈髖30°，髖外展15°，盡量伸直膝關節，保持髕骨位于正前方，放射球管距離拍攝部位110 mm；2）拍攝側位片時取側臥位，左后肢伸直置于前側，右后肢被動屈髖70°、屈膝30°置于后側，放射球管距離拍攝部位110 mm；3）設置檢驗參數：工作電壓45 kVP，照射電流160 mA，照射量為5.02 mAs，曝光時間31 ms。

2.4.3 軟骨組織病理觀察 所有實驗兔左側脛骨關節面處進行軟骨取材，用鋒利骨鑿鑿至深達軟骨下骨層，軟骨獲取后需要修剪成大小合適組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中保存。經過脫水脫鈣等一系列處理后，用光學顯微鏡對軟骨組織情況觀察拍照。

2.4.4 軟骨損傷程度評價 采用Mankin 評分標準判定軟骨的損傷程度。

2.4.5 血清和關節液中炎癥因子水平測定 采用ELISA 法測定血清和關節液中 IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，具體檢測操作方法嚴格按照ELISA 試劑盒說明書上進行。

2.5 統計學方法

應用GraphPad Prism 9.00 對數據進行處理，用One-Way ANOVA 檢驗方差齊性的數據，采用配對t檢驗法進行組內比較，LSD-t 法進行組間比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組左膝關節活動度變化比較

見表1。

表1 各組左膝關節活動度變化比較（±s，n = 5） °

表1 各組左膝關節活動度變化比較（±s，n = 5） °

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與治療前比較，▲P ＜0.05

組別治療前治療后空白組138.40±1.67140.00±3.00模型組 91.40±3.85#100.80±4.38腰腿痛寧組 88.20±5.67#128.40±6.39△▲仙靈骨葆組 90.00±7.52#130.20±4.32△▲

3.2 各組左膝關節X線影像學比較

各組X 線片結果顯示，空白組兔膝關節雙側髁間隙距離等寬，脛骨平臺輪廓清晰，未見骨贅；模型組外側髁間隙明顯變窄，脛骨平臺關節面粗糙不平，可見髁間隆起變銳，軟骨下骨骨質硬化，骨贅形成；仙靈骨葆組外側髁間隙窄于內側，髁間隆起變銳，骨贅形成；腰腿痛寧組關節間隙未見明顯異常，髁間隆起稍變銳，骨贅形成。見圖1。

圖1 各組左膝關節X線影像學比較

3.3 各組病理組織HE 染色結果

HE 結果顯示，空白組軟骨組織染色均勻，表面光滑，細胞形態結構正常、排列規則，潮線完整；與空白組比較，模型組軟骨組織顯示局部軟骨細胞排列不規則，有多處裂隙，出現陷窩，符合骨關節炎病理改變，提示造模成功；仙靈骨葆組關節軟骨中可見裂隙，軟骨欠光澤，關節面稍不平整，但情況好于模型組；腰腿痛寧組顯示關節軟骨中可見少量裂隙，關節表面較光滑平整，結構改善。見圖2。

圖2 各組病理組織HE 染色結果

3.4 各組治療后左膝關節軟骨Mankin 評分比較

見表2。

表2 各組治療后左膝關節軟骨Mankin 評分比較（±s，n = 5） 分

表2 各組治療后左膝關節軟骨Mankin 評分比較（±s，n = 5） 分

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別評分空白組0.00±0.00模型組5.00±0.71#腰腿痛寧組2.20±0.84△仙靈骨葆組2.40±1.14△

3.5 各組治療后血清中炎癥因子水平比較

見表3、圖3。

圖3 各組治療后血清中炎癥因子水平比較

表3 各組治療后血清中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

表3 各組治療后血清中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白組106.18±9.80 106.18±9.80410.25±43.05模型組152.75±4.03# 152.75±4.03# 674.42±38.30#腰腿痛寧組108.09±8.50△108.09±8.50△ 466.57±64.49△仙靈骨葆組108.64±4.19△108.64±4.19△ 463.47±57.85△

3.6 各組治療后關節液中炎癥因子水平比較

見表4、圖4。

圖4 各組治療后關節液中炎癥因子水平比較

表4 各組治療后關節液中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

表4 各組治療后關節液中炎癥因子水平比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白組 67.29±6.55 513.18±39.01113.36±24.54模型組100.63±11.29# 909.05±98.42# 179.67±13.27#腰腿痛寧組 74.02±9.44△542.71±106.08△132.60±30.20△仙靈骨葆組 76.62±9.75△542.02±99.51△ 124.46±28.15△

4 討論

骨關節炎與腎氣虧損致血瘀痹阻有關，患者伴有膝部疼痛，關節屈伸不利，甚則僵硬。本人經過數十載的臨床經驗總結出了“益腎填精、活血除痹”的獨特診治思路，研制出腰腿痛寧膠囊。此方藥具有益腎填精之效，可濡養骨骼強健經筋。方中選用鹿角霜，取其補腎陽亦強筋骨之用，在配伍熟地黃滋陰，益精填髓，二者同用平調陰陽，壯其筋骨。骨碎補能活瘀血，續斷傷，傳統中醫藥在治療骨折疾病時大量應用，有破血止血，補傷折之說。當歸可活血、亦補血；狗脊強筋骨，能止痛；黃芪補氣血，驅病邪。地龍，烏蛇，蜈蚣配伍，增強活血通絡之功，氣血聚處，祛邪以無痕。諸藥共用，周流氣血，通暢經脈，其病可愈。仙靈骨葆膠囊在診療指南（2020年版）[9]中為膝關節炎推薦用藥，臨床證實能有效改善膝骨性關節炎患者的各項指標[10]。將其作為陽性對照組藥物，能與腰腿痛寧膠囊組形成良好對照。

團隊前期實踐證明腰腿痛寧膠囊在治療 KOA 臨床療效顯著[11]，此次研究設計動物實驗主要探討其作用機制。木瓜蛋白酶能直接作用于兔關節軟骨，引起細胞外基質中蛋白多糖的降解[12]。蛋白多糖的缺失會相對增加膠原蛋白的暴露，促炎因子和基質金屬蛋白酶對基質的破壞也會加強，導致軟骨基質的大量流失[13]。然而，軟骨細胞新分泌的膠原蛋白等基質成分的性能較差，軟骨基質的生物和機械性能發生變化，軟骨失去正常的彈性和抗壓能力，最終導致骨關節退化[14]。這種方法可以避免手術引起的關節腔內出血、結構破壞等并發癥的干擾，適用于研究軟骨的病理變化和藥物對早期KOA 的治療效果。兔造摸后，左下肢均出現不同程度腫脹，皮溫升高情況。驅使兔被迫運動，可見兔左后肢因疼痛無法觸及地面，出現跛行。同時，抽取患肢關節液時，呈渾濁狀態，以上改變與早期KOA 病理發展基本一致，說明兔KOA 模型建立成功。

研究[15]發現，軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子的增加是骨關節炎的主要特征，炎癥在骨關節炎的發生發展中起核心作用。在骨關節炎的早期階段，分解代謝活性增加，這與炎癥介質、軟骨降解蛋白和應激反應因子的表達增加有關[16]。這些改變導致軟骨細胞丟失，從淺層的纖顫到更復雜和更深的裂隙[17]。IL-6 可以促進成纖維細胞的產生，并通過增強KOA 中IL-1β 和TNF-α 等細胞因子的破壞作用而加速軟骨基質的降解[18-19]。同時，TNF-α也可誘導 IL-1、IL-6 等的釋放，它們之間相互影響，共同作用于骨關節炎發生、發展的各個環節[20]。給藥28 d 后，藥物治療組脛骨軟骨表面粗糙度減弱，軟骨細胞排列更加整齊，同時血清和關節液中的炎癥因子明顯減少。驅趕兔被迫運動時，治療組后肢蹬地有力，而模型組仍有不同程度跛行。實驗中兔關節損傷程度基本與炎癥因子水平呈正相關，說明通過抑制血清和關節液中1L-1β、IL-6、TNF-α 水平可以延緩KOA 病情發展。

本研究結果顯示，經腰腿痛寧膠囊干預后，兔早期KOA 模型血清和關節液中1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平均明顯降低。說明腰腿痛寧膠囊能延緩軟骨的退化，其作用機制可能與降低炎癥因子水平有關。由于腰腿痛寧膠囊是中藥復方制劑，且KOA 發病機制復雜，所以其藥物有效成分和作用靶點需進一步深入研究。