氯化鑭對低磷脅迫下綠豆生理特性及相關基因表達的影響

秦成 申潔 祁茂冬 合展 連慧達

摘要：磷是植物體內第二大營養元素，土壤磷含量不足會引起植物生長發育緩慢。為探究氯化鑭（LaCl3）對低磷脅迫下綠豆幼苗的緩解效應，以晉綠豆8號為供試材料，采用水培法，設置4個處理，分別為正常（CK）、低磷脅迫（LP）、正常條件噴施氯化鑭（CK+La）、低磷脅迫噴施氯化鑭（LP+La），對綠豆幼苗進行了光合特性及相關基因表達水平、抗氧化系統及滲透調節等方面的研究。結果表明，低磷脅迫導致綠豆活性氧積累、光合特性及葉綠素含量降低，顯著抑制綠豆幼苗的生長；而低磷脅迫下噴施LaCl3能夠有效激活參與光合作用過程的PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY基因的表達，綠豆幼苗的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）、葉綠素含量均提高，提升了抗氧化酶（SOD、CAT）活性、滲透保護物質（可溶性糖、脯氨酸）含量，降低了花青素含量、胞間CO2濃度（Ci）、丙二醛（MDA）、H2O2含量；同時綠豆幼苗大量元素（N、P、K）含量顯著提高。綜上所述，LaCl3可以增強綠豆幼苗耐低磷性，促進綠豆生長，可為鑭肥的開發利用及綠豆栽培調控提供理論依據。

關鍵詞：氯化鑭；綠豆幼苗；低磷脅迫；光合特性；滲透保護物質；抗氧化酶活性

中圖分類號：S522.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0105-06

基金項目：山西省青年基礎研究計劃（編號：20210302124144、20210302124362）；山西省高等學校科技創新項目（編號：2021L517）；國家食用豆產業技術體系項目（編號：CARS-08-G10）。

作者簡介：秦 成（1993—），女，山西長治人，博士，講師，現主要從事植物逆境生理等研究工作。E-mail：qc332084910@163.com。

通信作者：連慧達，博士，副教授，現主要從事作物逆境栽培生理生態等研究工作。E-mail：lianhuidada@163.com。

綠豆（Vigna radiata L.）屬豆科作物，作為中國主要的食用豆類之一，廣泛種植于溫帶、亞熱帶、熱帶地區［1］。綠豆具有生育期短，適播期長，適應性廣，耐旱、耐貧等生長優點，同時具有高蛋白、中淀粉、低脂肪的特點，含有豐富的維生素和礦物質及許多生物活性物質，其營養價值、藥用價值和保健價值較高，被廣泛應用于食品、釀造、醫藥、工業等領域［2］。但因綠豆屬于小宗作物，多種植在土壤貧瘠的干旱、半干旱地區，土壤的質量和肥力嚴重制約了綠豆產量及產業的發展［3］。

磷作為植物生長發育過程所需的第二大礦質營養元素［4］，參與生物體內許多重要的酶促反應及代謝調節過程，是目前綠豆產區制約產量和品質的主要限制因素之一［5］。磷肥的當季利用率只有15%左右，大部分的磷殘留到土壤中，形成難溶化合物，使土壤中易被植物直接吸收的正磷酸鹽處于較低水平，導致作物面臨磷素攝入不足的現狀［6］。磷攝入不足將影響植物細胞分裂，致使植株矮小、葉片暗綠、根系發育受阻等；同時植物體內光合色素合成減少，蛋白質合成受阻，酶活性也發生改變。前人研究發現，低磷脅迫顯著提高了柱花草植株的丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）含量［7］。王月等研究結果表明，低磷條件下，番茄葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性、光合能力和葉綠素含量顯著降低［8］。陳潔等研究表明，低磷脅迫顯著抑制了紅豆草幼苗生長，增加其滲透調節物質含量（可溶性蛋白、脯氨酸）［9］。因此，探討低磷脅迫對綠豆幼苗形態及其抗氧化系統和滲透調節物質的影響，減輕低磷脅迫對綠豆生長的抑制作用是生產上亟待解決的問題。

近年來，以含鑭、鈰等輕稀土為主的元素廣泛應用于農林業，可達到促進植物生長和提高生產力的作用［10］。已有研究表明，適量的稀土鑭元素可以增強植物的抗逆能力，提高作物的光合能力，增加作物對養分的吸收利用和轉化，促進土壤釋放氮、磷、鉀等無機離子，從而提高作物的產量［6，11］。但尚未見噴施鑭后對綠豆生理影響方面的報道。為此，本研究設置2個磷水平（正常供磷和低磷脅迫），通過葉面噴施氯化鑭溶液，探究LaCl3對低磷脅迫下幼苗生長及滲透調節的作用，以期為鑭肥在農業生產中的合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試品種為晉綠豆8號，由山西農業大學種質資源平臺提供。試驗于2021年3—7月在長治學院智能溫室（36°12′N，113°8′E）進行。挑選飽滿一致的種子，經5% NaClO浸泡10 min后，用無菌水沖洗5次，置于內含2層濾紙的發芽盒中，放入2層濾紙（25 ℃，黑暗）內萌發。選取芽長一致的種子播種到含復合基質（蛭石、珍珠巖體積比為3 ∶1）的培養缽內（12 cm×15 cm），室內25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），相對濕度為70%；每 2～3 d 用 1/2 Hoagland 營養液澆灌，待幼苗第4片葉展開后，選取長勢健壯一致的綠豆幼苗（4株/每筐）移至水培筐中，緩苗 2 d 后，開始進行試驗處理。

試驗共分為4個處理：CK，正常磷營養液 （Hoagland營養液含磷量10 mg/L）+噴清水對照；LP，低磷脅迫 （含磷量為正常Hoagland營養液5%）+噴清水；CK+La，正常磷營養液+葉面噴施 100 μmol/L LaCl3；LP+La，低磷脅迫+葉面噴施100 μmol/L LaCl3。外源LaCl3采用葉面噴施的方式，通過預試驗，篩選100 μmol/L為噴施濃度，于每天18：00噴施，以葉片濕潤而不滴水為標準，每個處理重復3次，每次重復12株。處理12 d后，挑選長勢一致的幼苗，進行相關指標測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 植株形態指標及其干質量

綠豆幼苗的株高用直尺測定，葉面積采用方格法測定；將樣品放到烘箱105 ℃殺青1 h后80 ℃烘干至恒質量，稱量其地上地下部干物質量，各指標重復測定3次。

1.2.2 幼苗生理特性指標

自上而下選擇第3張完全展開的葉片，用 Li-6400XT 便攜式光合儀在09：00—11：30測定光合參數；葉綠素含量采用丙酮浸提法［12］測定，花青素含量參照李紅艷等的方法［13］測定。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法測定；可溶性糖含量、脯氨酸含量、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化氫（H2O2）含量參照高俊鳳的方法［12］測定。凱氏定氮儀測定全氮；釩鉬黃比色法測定全磷；火焰光度法［12］測定全鉀。

1.2.3 基因表達分析

綠豆幼苗葉片用超純水清洗 2～3 次，用濾紙吸干表面水分，迅速置于液氮中冷凍，用于RNA 提取。總 RNA 的提取依據 RNA 提取試劑盒（博日）說明書進行。cDNA參照TaKaRa公司的反轉錄試劑盒說明書制備。實時熒光定量 qRT-PCR（quantitative real-time PCR）使用BioEasy master Mix（博日）試劑盒進行反應。所有引物的序列均采用Primer 5.0軟件進行設計（表1）。研究了4個參與光合作用的基因PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY。以肌動蛋白為內參基因，并通過2-ΔΔCT方法計算相對表達［14］。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行整理，IBM SPSS Statistics 2軟件進行統計分析，用Duncans新復極差測驗法（α=0.05）進行單因素顯著性方差分析，采用Origin 2019作圖。數據結果展示均為平均數±標準差。

2 結果與分析

2.1 外源LaCl3對低磷脅迫下綠豆幼苗生長的影響

由表2可知，綠豆幼苗的株高、干質量及葉面積在低磷脅迫下均顯著降低，與對照相比，LP處理導致株高、干質量、葉面積分別降低32.80%、48.37%、30.12%。與對照相比，CK+La處理后幼苗株高增加14.83%，差異達顯著水平。LP+La處理比LP處理的株高、干質量、葉面積分別提高了21.02%、43.16%、16.96%，差異達顯著水平。

2.2 外源LaCl3對低磷脅迫下綠豆幼苗光合參數及色素含量的影響

由圖1可知，與CK相比，LP處理導致綠豆幼苗葉片的Pn、Tr、Gs均降低，分別降低23.31%、35.25%、47.64%，而Ci增加了28.97%。與CK處理相比，CK+La處理后綠豆幼苗葉片的Pn值提高39.87%，增幅較大。LP+La處理比LP處理的幼苗葉片Pn、Tr、Gs分別提高了15.42%、30.89%、77.21%，差異達顯著水平；而幼苗葉片Ci降低了15.47%，表明LaCl3處理能有效緩解低磷脅迫對綠豆幼苗造成的光合損傷。

LP處理導致綠豆幼苗葉綠素含量降低，與CK組相比降低43.68%，差異達顯著水平；而LP+La處理能夠有效提高葉片葉綠素含量，相比LP處理增幅為36.03%，表明LaCl3處理可以明顯增加低磷脅迫下綠豆幼苗葉片的葉綠素含量。LP處理使綠豆幼苗葉片的花青素含量顯著增加，是CK處理的2.38倍；與LP處理相比，LP+La處理后葉片的花青素含量顯著降低，降幅為25.75%，表明LaCl3能減緩低磷脅迫下綠豆葉片花青素含量的積累。

2.3 外源LaCl3對低磷脅迫下綠豆幼苗葉片MDA、H2O2含量的影響

由圖2可知，與CK相比，LP處理后綠豆幼苗葉片的MDA、 H2O2含量均顯著增加 增幅為1.05、1.03倍。CK+La處理后的MDA、H2O2含量較CK處理下降，均未達顯著水平。與LP處理相比，LP+La處理后綠豆葉片的MDA、H2O2含量顯著降低，分別降低27.81%、20.56%。

2.4 外源LaCl3對低磷脅迫下綠豆幼苗葉片滲透保護物質和抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，與CK處理相比，LP處理下綠豆葉片的可溶性糖、脯氨酸含量分別增加了1.07、0.93倍，差異達顯著水平，LaCl3處理可顯著提高綠豆葉片的可溶性糖、脯氨酸含量。與LP處理相比，LP+La處理后葉片的可溶性糖、脯氨酸含量顯著增加了13.34%、12.77%。與CK相比，LP處理下綠豆幼苗SOD、CAT活性均升高，其中SOD增幅較大，為74.33%。與LP處理相比，LP+La處理后葉片的SOD活性增加28.81%，差異達顯著水平。表明LaCl3可顯著提高低磷脅迫下滲透保護物質的含量及抗氧化酶活性。

2.5 外源LaCl3對低磷脅迫下綠豆幼苗大量元素N、P、K含量的影響

由表3可知，與CK處理相比，LP處理下綠豆幼苗的N、P、K含量均顯著降低，降幅分別為45.25%、39.75%、53.01%。CK與CK+La處理間綠豆幼苗N、P、K含量同樣存在差異，P、K含量差異達顯著水平。與LP處理相比，LP+La處理后綠豆幼苗的N、P、K含量顯著提高，分別為49.27%、27.60%、48.27%；說明低磷條件下LaCl3能有效緩解大量元素不足而引起的綠豆幼苗生長緩慢。

2.6 外源LaCl3對低磷脅迫下綠豆幼苗參與光合相關基因表達的影響

由圖4可知，與對照相比，LP處理顯著下調PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY的表達，分別下調了39.63%、49.6%、26.27%、39.57%。與LP處理相比，LP+La處理后顯著上調PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY的表達，分別上調了32.41%、59.52%、22.61%、32.43%。與對照相比，CK+La處理上調了PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY的表達，但僅PsbO、PsbQ、PsbY呈顯著上調，分別上調了20.37%、22.6%、19.63%。

3 討論

鑭能夠調節植物的生長發育，提高植物抵御環境脅迫的能力，如干旱［15］、低溫［16］、鹽堿［17］及重金屬［18］等。而鑭能否緩解植物響應營養脅迫尚不明確。

本研究發現，低磷脅迫下綠豆幼苗的株高、葉面積、整株干質量明顯低于對照，這與前人的研究結論一致［19］。噴施外源LaCl3有效緩解低磷脅迫對綠豆幼苗的損害，顯著提高株高、葉面積、整株干質量。葉片光合速率（Pn）是植物積累生物量的重要的決定因素之一［20］。本研究中，低磷脅迫導致綠豆幼苗Pn、Tr、Gs顯著降低；而噴施LaCl3可有效緩解低磷脅迫時葉片氣孔的閉合程度，促進植物對CO2的吸收，從而提高植物的光合能力。Wang等研究表明，低濃度的La3+會通過激活核酮糖1，5-二磷酸羧化酶活性進而提高植物的光合速率［21-22］ 。總葉綠素含量下降是色素光氧化和葉綠素降解的典型跡象，植物葉綠素代謝生物合成的調節取決于環境脅迫的強度和類型。噴施LaCl3可有效緩解低磷脅迫導致的綠豆葉綠素含量降低，這可能是因為鑭能夠控制植物光合色素的降解，保護了光反應系統，進而提高了低磷脅迫下綠豆幼苗的光合能力。PsbO、PsbP、PsbQ蛋白一起形成類囊體管腔，是高等植物的氧氣進化復合體的一部分，起到穩定PSⅡ光抑制產生ROS的至關重要的作用［23］。PsbY是對原核復合體組裝和光保護至關重要的蛋白［24］。本研究中，與低磷脅迫植株相比，葉面噴施氯化鑭效果顯著，4個PSⅡ相關基因（PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY）的表達上調，這表明，LaCl3通過調控光合作用相關基因表達的增加，導致PSⅡ光化學效率的提高。缺磷脅迫后的植物通常會積累花青素。缺磷條件下，葉片的光合速率變小、花青素積累增加、葉片呈紫色［25］。花青素的積累可以保護核酸和葉綠體免受磷饑餓引起的損害［26］。本研究結果表明，低磷脅迫導致綠豆幼苗葉片的花青素含量顯著增加，而噴施LaCl3處理能減緩低磷脅迫下綠豆葉片花青素含量的積累。

逆境脅迫下，過量的ROS積累會導致脂質過氧化損傷和細胞死亡。MDA含量可以作為自由基損傷細胞膜的指標。在本研究中，由于ROS的產生，缺磷脅迫下，H2O2、MDA含量顯著增加。然而，噴施LaCl3可有效抑制H2O2、MDA的累積。這一發現與其他研究的結果一致，如鑭處理可降低冷脅迫下的蠶豆植株的MDA含量，并增加植物抗氧化防御系統的活性［27］。植物通過合成積累滲透調節物質來抵御不良環境，此外，抗氧化防御能力是植物適應缺磷的重要機制之一。噴施LaCl3可增加可溶性糖和脯氨酸含量，提高抗氧化酶SOD、CAT的活性。Pang等研究指出，鑭可增強氧自由基的清除能力，并最終提高小麥的耐鉛性［28］。說明LaCl3起到抗氧化劑的作用，不僅可以刺激抗氧化系統，降低綠豆幼苗在低磷脅迫下H2O2的累積，還可以提高低磷脅迫下抗氧化酶的活性和抗氧化潛力。

許多研究表明，稀土元素可以刺激植物吸收、轉移、同化養分的能力，而且稀土元素在植株體外對磷酸根離子具有很強的親和力［29］。本試驗結果表明，低磷脅迫下噴施LaCl3可顯著提高綠豆幼苗N、P、K的含量。含稀土元素的肥料可以起到調控磷吸收的作用，與前人研究結果［30］一致。

4 結論

外源LaCl3 可促進低磷脅迫下綠豆幼苗對N、P、K元素的吸收并增加綠豆的株高、葉面積、整株干質量，同時提高綠豆幼苗的葉綠素含量及光合能力，上調PsbO、PsbP、PsbQ、PsbY光合作用相關蛋白基因的表達和活性；提高滲透保護物質（可溶性糖、脯氨酸）含量，并誘導抗氧化酶（SOD、CAT）活性的增加，降低葉片的花青素、MDA、H2O2的含量，以清除活性氧積累，降低膜質過氧化程度，緩解低磷脅迫對綠豆植株造成的傷害。

參考文獻：

［1］柴 巖，馮佰利. 中國小雜糧產業發展現狀及對策［J］. 干旱地區農業研究，2003，21（3）：145-151.

［2］高小麗，高金鋒，馮佰利，等. 西部有機特色小雜糧產業發展戰略研究［J］. 干旱地區農業研究，2006，24（6）：227-230.

［3］程須珍，王素華，田 靜，等. 綠豆優異種質綜合評價［J］. 中國農業科學，1999，32（增刊1）：36-39.

［4］張福鎖，王激清，張衛峰，等. 中國主要糧食作物肥料利用率現狀與提高途徑［J］. 土壤學報，2008，45（5）：915-924.

［5］Vance C P，Uhde-Stone C，Allan D L. Phosphorus acquisition and use：critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource［J］. The New Phytologist，2003，157（3）：423-447.

［6］Chen Q，Qu Z M，Li Z L，et al. Coated diammonium phosphate combined with humic acid improves soil phosphorus availability and photosynthesis and the yield of maize［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12：759929.

［7］王金鵬，廖 麗，劉國道，等. 低磷脅迫對柱花草生長及抗氧化系統的影響［J］. 熱帶作物學報，2021，42（10）：2875-2880.

［8］王 月，王魯鑫，李浩天，等. 不同磷水平下CO2濃度升高對番茄光合特性和抗氧化酶活性的影響［J］. 江蘇農業科學，2022，50（12）：163-167.

［9］陳 潔，魏少萍，梁鵬飛，等. 不同紅豆草材料耐低磷性評價及種質篩選［J］. 中國草地學報，2022，44（3）：72-80.

［10］Lian H D，Qin C，Zhang C，et al. Foliar-applied lanthanum chloride increases growth and phosphorus acquisition in phosphorus-limited adzuki bean seedlings［J］. Plant and Soil，2019，442（1）：385-399.

［11］任紅玉，王 亮，趙慧莉，等. 稀土對東北大豆葉片脯氨酸含量的影響［J］. 中國稀土學報，2015，33（4）：480-486.

［12］高俊鳳. 植物生理學試驗指導［M］. 北京：高等教育出版社，2006.

［13］李紅艷，李潔雅，李 響，等. 過表達LrAN2基因對馬鈴薯中花青素和糖苷生物堿含量的影響［J］. 作物學報，2023，49（4）：988-995.

［14］Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR［J］. Nucleic Acids Research，2001，29（9）：e45.

［15］王宇辰，陳孟起，李耀光，等. 鑭處理對干旱脅迫下煙草根系形態與生理特征的影響［J］. 中國稀土學報，2018，36（3）：319-327.

［16］段曉宇，唐 敏，汪維雙，等. 三氯化鑭對一品紅組培苗抗寒性的影響［J］. 北方園藝，2013（9）：73-77.

［17］付英杰，劉月帥，李艷芝，等. 氯化鑭對不同濃度鹽、堿脅迫條件下不同種薄荷抗逆性的影響［J］. 中國藥房，2017，28（31）：4376-4380.

［18］吳文杰，張意萍. 鑭對銅脅迫紅豆幼苗和根尖生長的影響［J］. 作物雜志，2012（1）：96-98.

［19］索炎炎，張 翔，司賢宗，等. 施用磷和鈣對花生生長、產量及磷鈣利用效率的影響［J］. 作物雜志，2021（1）：187-192.

［20］林鄭和，陳榮冰，郭少平. 植物對缺磷的生理適應機制研究進展［J］. 作物雜志，2010（5）：5-9.

［21］Wang E L，Bell M，Luo Z K，et al. Modelling crop response to phosphorus inputs and phosphorus use efficiency in a crop rotation［J］. Field Crops Research，2014，155：120-132.

［22］Pang J Y，Zhao H X，Bansal R，et al. Leaf transpiration plays a role in phosphorus acquisition among a large set of chickpea genotypes［J］. Plant，Cell & Environment，2018，41（9）：2069-2079.

［23］von Sydow L，Schwenkert S，Meurer J，et al. The PsbY protein of Arabidopsis Photosystem Ⅱ is important for the redox control of cytochrome b559［J］. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics，2016，1857（9）：1524-1533.

［24］Zhang H H，Xu Z S，Guo K W，et al. Toxic effects of heavy metal Cd and Zn on chlorophyll，carotenoid metabolism and photosynthetic function in tobacco leaves revealed by physiological and proteomics analysis［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2020，202：110856.

［25］孫麗超. 擬南芥PHL2和PHR1共同調控對低磷脅迫的轉錄響應［D］. 北京：清華大學，2015.

［26］杜宇倩，于國康，王夢怡，等. 氮磷鉀肥對馬鈴薯新品種黑美人產量、淀粉及花青素含量的影響［J］. 天津農業科學，2020，26（7）：75-77，85.

［27］Wang C R，Lu X W，Tian Y，et al. Lanthanum resulted in unbalance of nutrient elements and disturbance of cell proliferation cycles in V. faba L.seedlings［J］. Biological Trace Element Research，2011，143（2）：1174-1181.

［28］Pang X，Wang D H，Xing X Y，et al. Effect of La3+ on the activities of antioxidant enzymes in wheat seedlings under lead stress in solution culture［J］. Chemosphere，2002，47（10）：1033-1039.

［29］Ding S M，Liang T，Zhang C S，et al. Accumulation and fractionation of rare earth elements （REEs） in wheat：controlled by phosphate precipitation，cell wall absorption and solution complexation［J］. Journal of Experimental Botany，2005，56（420）：2765-2775.

［30］Lian H D，Qin C，Zhang L，et al. Lanthanum nitrate improves phosphorus-use efficiency and tolerance to phosphorus-deficiency stress in Vigna angularis seedlings［J］. Protoplasma，2019，256（2）：383-392.