甲殼素衍生物調控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表達的臨床研究

陳雷剛，周向昭，王世寧，李亞維，劉媛媛，李坤

[摘要]目的：甲殼素衍生物調控瘢痕疙瘩中腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）/磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶-B（AKT）通路表達的作用。方法：選擇2020年1月-2021年10月筆者醫院接受手術切除的76例瘢痕疙瘩患者為研究對象，根據術前是否使用甲殼素衍生物分為甲殼素組（n=41）和對照組（n=35）。手術后，收集瘢痕疙瘩組織，采用免疫組化法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）的陽性表達率；采用TUNEL法檢測細胞凋亡率；采用western blot檢測TSG-6、p-PI3K、p-AKT、鼠雙微基因2（MDM2）、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、裂解型caspase-3（Cleaved caspase-3）的表達水平；采用酶聯免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6的含量。結果：甲殼素組瘢痕疙瘩組織中PCNA陽性表達率、p-PI3K、p-AKT、MDM2、Bcl-2的表達水平、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量低于對照組（P＜0.05），細胞凋亡率、TSG-6及Cleaved caspase-3的表達水平高于對照組（P＜0.05）。結論：甲殼素衍生物可調控瘢痕疙瘩中的細胞增殖及凋亡，這一作用與調控TSG-6/PI3K/AKT通路有關。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩；甲殼素；TSG-6/PI3K/AKT通路；凋亡；炎癥反應

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）04-0071-04

Clinical Study of Chitin Derivatives Regulating the Expression of TSG-6/PI3K/Akt Pathway in Keloid

CHEN Leigang1，ZHOU Xiangzhao1，WANG Shining1，LI Yawei1，LIU Yuanyuan1，LI Kun2

（1.Department of Dermatology; 2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Abstract： Objective? To study the effect of chitin derivatives in regulating tumor necrosis factor alpha stimulatedgene-6 （TSG-6）/phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）/serine protein kinase-B （AKT） pathway expression in keloid. Methods? 76 patients with keloid who underwent surgical resection in our hospital from January 2020 to October 2021 were selected as the research object and divided into chitin group （n= 41） and control group （n= 35） according to whether to use chitin derivative before operation. After operation， keloid tissues were collected. The positive expression rate of PCNA was detected by immunohistochemical method， the apoptosis rate was detected by TUNEL method， and the expression levels of TSG-6， p-PI3K， p-AKT， mouse double microgene 2 （MDM2）， B cell lymphoma-2 gene （Bcl-2） and cleaved caspase-3 were detected by Western blot， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， IL-1β， IL-6 content were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Results? In chitin group， the positive expression rate of PCNA， the expression levels of p-PI3K， p-AKT， MDM2， Bcl-2 and the contents of TNF-α， IL-1β， IL-6 were lower than those in the control group （P＜0.05）， and the apoptosis rate and the expression level of TSG-6 and cleaved caspase-3 were higher than those in the control group （P＜0.05）. Conclusion? Chitin derivatives regulate cell proliferation and apoptosis in keloid， which is related to the regulation of TSG-6/PI3K/Akt pathway.

Key words： keloid; chitin; TSG-6/PI3K/Akt pathway; apoptosis; inflammatory reaction

皮膚創傷愈合是十分精細而復雜的修復過程，但是過度愈合會造成增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等病理性瘢痕的發生[1-2]。瘢痕疙瘩形成的病理基礎是結締組織過度增生與透明變性，腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）/磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶-B（AKT）通路介導的瘢痕疙瘩成纖維細胞的不斷增生及凋亡在該過程中發揮重要作用[3]。瘢痕疙瘩患者會出現局部瘙癢、疼痛等不適癥狀，嚴重者可導致瘢痕性攣縮，尤其在關節處瘢痕攣縮常導致嚴重功能障礙，因此皮膚創傷愈合過程中瘢痕疙瘩的防治及相關機制的研究是重要臨床課題。甲殼素是廣泛存在于低等動物外殼細胞壁中的一種天然生物高分子，有臨床研究報道，甲殼素衍生物對燒傷創面的愈合具有促進作用[4-5]；有動物實驗證實，甲殼素衍生物對瘢痕形成具有抑制作用[6]，但目前甲殼素衍生物治療瘢痕疙瘩的作用及機制尚缺乏臨床證據。本研究將以接受手術切除治療的瘢痕疙瘩患者為對象，觀察甲殼素衍生物對瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表達的調控作用，旨在為深入認識甲殼素衍生物在瘢痕疙瘩中的防治作用提供循證醫學證據。

1? 資料和方法

1.1 一般資料：選擇2020年1月-2021年10月筆者醫院接受手術切除的76例瘢痕疙瘩患者為研究對象，根據手術前是否使用甲殼素凝膠治療分為甲殼素組和對照組，兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

1.2 納入標準：①通過手術對瘢痕疙瘩進行切除者；②術前未接受任何治療或僅接受過甲殼素凝膠涂抹者；③患者知曉并簽署知情同意書。

1.3 排除標準：①合并惡性腫瘤、免疫功能紊亂、血液系統疾病；②合并其他皮膚疾病；③手術標本未保留。

1.4 方法

1.4.1 兩組患者術前瘢痕疙瘩治療：甲殼素組術前將改性甲殼素創面修復凝露（20克/支）涂于瘢痕疙瘩組織，涂抹厚度＞1 mm，涂抹范圍超過創緣1 cm，每天2次，連續涂抹14 d；對照組術前不接受任何治療。

1.4.2 標本收集及保存：收集手術切除的瘢痕疙瘩組織，生理鹽水清洗后分為兩份，一份放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，而后進行石蠟包埋，蠟塊室溫保存；另一份放入凍存管，在液氮中冷凍30 min，取出后放入-80℃超低溫保存箱保存。

1.4.3 免疫組化法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）陽性表達率：取瘢痕疙瘩的蠟塊，制作厚度4μm的病理切片，采用SP二步法免疫組織化學試劑盒（上海邦奕生物公司）進行檢測，孵育PCNA的一抗（1：200稀釋，SantaCruz公司），顯微鏡下觀察，PCNA的染色部位主要為細胞核，用已知陽性片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替PCNA一抗作陰性對照，盲法讀片并判定PCNA的陽性表達情況、計算陽性表達率。陽性表達率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.4.4 TUNEL法檢測細胞凋亡率：取瘢痕疙瘩的蠟塊，制作厚度4μm的病理切片，采用TUNEL試劑盒（上海碧云天公司）進行檢測，分別進行TUNEL染色和DAPI染色，抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下觀察染色情況，對TUNEL陽性細胞和DAPI陽性細胞進行計數。細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞數/DAPI陽性細胞數×100%。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達水平：取凍存的瘢痕疙瘩組織約30 mg，加入組織裂解液（上海碧云天公司），勻漿提取組織蛋白，蛋白定量后將含有30μg蛋白的樣本用于Western blot檢測，蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離不同分子量的蛋白后電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉后1：1 000稀釋的TSG-6、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT、Bcl-2、MDM2、Cleaved caspase-3特異性一抗4℃孵育過夜，次日孵育1：2 000稀釋的二抗1 h。最后，將硝酸纖維素膜放入凝膠成像儀（Bio-rad公司）中，化學發光得到蛋白條帶，計算TSG-6、Bcl-2、MDM2、Cleaved caspase-3灰度值與β-actin灰度值的比值及p-PI3K、p-AKT灰度值與PI3K、AKT灰度值的比值。

1.4.6 Elisa法檢測細胞因子含量：取凍存的瘢痕疙瘩組織約30 mg，加入組織裂解液（上海碧云天公司），勻漿提取組織蛋白，采用Elisa試劑盒（上海西唐公司）檢測勻漿液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度，采用BCA法試劑盒（上海碧云天公司）檢測勻漿液中蛋白濃度，計算TNF-α、IL-1β、IL-6濃度與蛋白濃度的比值，得到每毫克蛋白中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.5 統計學分析：采用SPSS 21.0分析數據，計數資料以[例（%）]表示，采用卡方檢驗進行兩組間比較；計量資料以（x?±s）表示，采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 甲殼素組治療前后瘢痕疙瘩大體觀察：所有患者經甲殼素治療后瘢痕疙瘩的形態均得到了一定程度的改善，典型病例見圖1。

2.2 兩組患者瘢痕疙瘩組織中PNCA陽性表達率及細胞凋亡率比較：甲殼素組PNCA陽性表達率低于對照組，細胞凋亡率高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖2～3。

2.3 兩組患者瘢痕疙瘩組織中TSG-6、p-PI3K、p-AKT通路表達水平比較：甲殼素組患者瘢痕疙瘩組織中TSG-6的表達水平高于對照組，p-PI3K、p-AKT的表達水平低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖4。

2.4 兩組患者瘢痕疙瘩組織中凋亡基因表達水平比較：甲殼素組患者瘢痕疙瘩組織中Bcl-2、MDM2的表達水平低于對照組，Cleaved caspase-3的表達水平高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖5。

2.5 兩組患者瘢痕疙瘩組織中炎癥細胞因子含量比較：甲殼素組患者瘢痕疙瘩組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

3? 討論

瘢痕疙瘩是皮膚創傷愈合過程中異常形成的病理性瘢痕，外觀為高于皮膚的暗紫色硬質腫塊，常超出皮膚創傷范圍呈蟹足狀生長，直接影響外觀及功能，對患者的身心健康均造成不利影響。瘢痕疙瘩的治療手段包括手術、藥物、激光、冷凍、放療等，治療后局部組織中異常增生的成纖維細胞會造成瘢痕疙瘩復發，不同治療手段的療效均不盡如人意[7-8]。因此，深入探索瘢痕疙瘩的發病機制、發現新的瘢痕疙瘩治療手段具有迫切的臨床需求。

甲殼素又名幾丁質，是殼制動物中提取得到的氨基酸多肽，其衍生物具有廣泛的生物學功能，可以與結合脂肪酸結合，參與乳化并起到降脂作用，也能與腫瘤分子結合，調控免疫應答，并起到抗腫瘤作用[9-10]。近年來，甲殼素衍生物的外用制劑被越來越多的用于臨床治療。甲殼素凝膠、甲殼素生物修復膜等用于感染創面的治療，能夠起到抑菌、抗感染作用[11-12]，用于燒傷創面的治療，能夠改善血液循環、加速創面愈合[4-5]。在多項甲殼素用于燒傷創面治療的臨床研究中，使用甲殼素治療的創面均未出現瘢痕愈合[4-5]。另有動物實驗在皮膚缺損大鼠模型中觀察到甲殼素顯著抑制瘢痕增生[6]。以上結果提示，甲殼素可能具有抑制瘢痕增生、治療瘢痕疙瘩的價值。

目前，關于甲殼素治療瘢痕疙瘩的研究均只停留在基礎研究階段，尚缺乏相關的臨床研究證據。本文設計了非隨機對照臨床研究，旨在獲得甲殼素治療瘢痕疙瘩的臨床證據，這也是本研究的獨特性和創新性所在。成纖維細胞的過度增殖、凋亡減少是瘢痕疙瘩形成的重要生物學環節[13-14]。為了探索甲殼素治療瘢痕疙瘩的價值，本研究在甲殼素治療后檢測了瘢痕疙瘩中PCNA的表達水平及凋亡水平。PCNA是細胞增殖的標志基因，其陽性表達水平反映了局部組織中的細胞增殖水平；TUNEL法檢測細胞凋亡率直接反映細胞凋亡水平。本研究的結果顯示：使用甲殼素凝膠治療的瘢痕疙瘩組織中PCNA的陽性表達率低于對照組，細胞凋亡率高于對照組，表明甲殼素對瘢痕疙瘩中的細胞增殖具有抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用，進而也提示甲殼素對瘢痕疙瘩具有一定的治療價值。

本研究還深入探索了甲殼素發揮上述作用的可能分子機制。TSG-6蛋白在瘢痕疙瘩形成過程中發揮關鍵作用，該蛋白在正常組織和細胞中幾乎不表達，在炎癥、外傷等刺激下表達增加并通過下游PI3K/AKT通路進行信號轉導，進而參與細胞增殖、凋亡及炎癥反應的調控[15-16]。已有細胞實驗在瘢痕疙瘩成纖維細胞中證實過表達TSG-6使PI3K/AKT通路失活、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，降低TSG-6使PI3K/AKT通路激活、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。本研究通過檢測瘢痕疙瘩組織中該通路的表達可知：使用甲殼素凝膠治療的瘢痕疙瘩組織中TSG-6的表達水平高于對照組，p-PI3K、p-AKT的表達水平低于對照組，表明甲殼素調控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路，這一作用與甲殼素對瘢痕疙瘩中細胞增殖的抑制作用、細胞凋亡的促進作用吻合。

TSG-6所調控的PI3K/AKT通路是調控細胞增殖、凋亡及炎癥反應的經典信號通路。該通路激活后，顯著增加MDM2、Bcl-2的表達，后兩者能夠抑制線粒體內細胞色素C的釋放、阻礙Cleaved caspase-3的生成，進而起到抑制凋亡、促進增殖的作用。同時，該通路還能起到抗炎作用，顯著減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子的釋放。在瘢痕疙瘩形成過程中，炎癥細胞因子的大量生成已經被證實是刺激纖維結締組織增生的重要因素[17]。為了進一步明確甲殼素用于瘢痕增生治療時對TSG-6/PI3K/AKT通路的調控作用，本研究進一步檢測了通路下游效應基因及分子的水平。結果顯示：使用甲殼素凝膠治療的瘢痕疙瘩組織中MDM2、Bcl-2的表達水平及TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均降低，Cleaved caspase-3的表達增加，表達甲殼素對疤痕疙瘩中增殖及凋亡基因的表達、炎癥細胞因子的生成均具有調控作用。

綜上所述，甲殼素衍生物可調控瘢痕疙瘩中細胞增殖及凋亡，這一作用與調控TSG-6/PI3K/AKT通路有關，這為今后深入認識甲殼素在瘢痕疙瘩中的防治作用及分子機制提供了臨床研究證據。

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[收稿日期]2022-02-25

本文引用格式：陳雷剛，周向昭，王世寧，等.甲殼素衍生物調控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表達的臨床研究[J].中國美容醫學，2023，32（4）：71-75.