XPC rs2228000位點多態性與乳腺癌發病的關系

李 牧 龔東亮 徐黎明 彭 榮

（1.復旦大學附屬中山醫院青浦分院檢驗科，上海 201700；2.復旦大學附屬中山醫院青浦分院骨科，上海 201700）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，尋找乳腺癌的危險因素和誘發因素，并加以控制，將對乳腺癌的防治起積極作用[1]。有研究發現，病變細胞必須以特異性的修復機制來進行修復[2]，而著色性干皮病基因組C（xeroderma pigmentosum group C，XPC）編碼的蛋白在早期DNA損傷修復中起關鍵作用[3]。為進一步探討XPCrs2228000（Ala499Val）位點多態性在乳腺癌中的作用，本研究擬采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）檢測XPC基因，并分析XPCrs2228000位點多態性與乳腺癌發病的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年3月—2020年3月復旦大學附屬中山醫院青浦分院女性乳腺癌患者562例（乳腺癌組），年齡（43.0±9.4）歲。納入標準：經組織病理學檢查明確診斷為原發性乳腺癌。排除標準：1）合并其他腫瘤；2）不愿意參加本研究。另選取同期復旦大學附屬中山醫院青浦分院體檢健康女性572名（正常對照組），年齡（45.0±10.2）歲。納入標準：1）與病例無親緣關系；2）體格檢查和實驗室常規項目（血常規、肝功能、腎功能等）檢測均正常。本研究經復旦大學附屬中山醫院青浦分院倫理委員會批準（青醫2022-59），所有研究對象均簽署知情同意書，自愿完成流行病學調查。所有患者自愿提供術前、術后、化療后的外周血樣本。

1.2 方法

1.2.1 問卷調查

采用自主設計的問卷進行調查，收集所有研究對象的年齡、妊娠次數、分娩次數、婚姻狀況等一般資料，收集乳腺癌患者的絕經情況、腫瘤類型、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、BRCA1基因表達情況等臨床病理資料。

1.2.2 樣本采集

采集正常對照者體檢當日和乳腺癌患者術前1周、術后（化療后）6周的空腹靜脈血樣本5 mL，-80 ℃保存備用。

1.2.3 儀器和試劑

全血DNA提取試劑盒、10×PCR Buffer、dNTP mixture、rTaqDNA聚合酶、10×T Buffer、限制性內切酶SacⅡ均購自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。DNA marker購自天根生化科技（北京）有限公司。TOne 96 G PCR擴增儀（德國Biometra公司）。MF-ChemiBIS 3.2電泳凝膠成像分析系統（以色列DNR公司）。

1.2.4XPCrs2228000（Ala499Val）位點多態性檢測

采用全血DNA提取試劑盒提取DNA。采用Primer 3.0軟件設計DNA引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物為5'-TAAGGACCCAAGCTTGCCCG-3'，下游引物為5'-CCCACTTTTCCTCCTGCTCACAG-3'。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，10.0 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，rTaq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模版4.0 μL，ddH2O 11.0 μL。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，63.3 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR-RFLP酶切反應體系：10×T Buffer 1 μL，0.1%牛血清白蛋白1 μL，限制性內切酶SacⅡ 0.5 μL，PCR 產物3 μL，ddH2O 4.5 μL。采用BeadXpress數碼微珠芯片系統（美國Illumina公司）進行批量單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點檢測，通過Sequenom Typer4.0軟件（美國Sequenom公司）確定基因型。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以x±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic回歸分析評估XPCrs2228000位點多態性與乳腺癌發病的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組與正常對照組一般資料比較

乳腺癌組和正常對照組年齡、妊娠次數、分娩次數、婚姻狀況差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 乳腺癌組與正常對照組一般資料比較

2.2 XPC rs2228000（Ala499Val）位點PCR擴增結果

PCR酶切產物經消化后在150 bp處產生特異性片段，見圖1。

圖1 PCR產物電泳圖

2.3 酶切產物電泳結果

采用限制性內切酶鑒定基因型，結果顯示，CC基因型在131 bp處有特異性條帶，TT基因型在150 bp處有特異性條帶。見圖2。

圖2 限制性內切酶酶切產物電泳結果

2.4 乳腺癌組和正常對照組XPC rs2228000位點基因型和等位基因分布頻率比較

所有研究對象的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（乳腺癌組：χ2=0.038，P=0.781；正常對照組：χ2=1.512，P=0.237），具有群體代表性。

乳腺癌組和正常對照組CC基因型（野生型）、CT基因型（雜合型）、TT基因型（純合型）和等位基因（C、T）的分布頻率差異均有統計學意義（P<0.01）。見表2。

表2 乳腺癌組與正常對照組XPC rs2228000位點基因型和等位基因分布頻率比較

Logistic回歸分析結果顯示，以CC基因型為對照，CT和TT基因型個體乳腺癌的發生風險顯著增高[比值比（odds ratio，OR）值分別為1.36、2.44，95%可信區間（confidence interval，CI）分別為1.06～1.75、1.64～3.65]；以C等位基因為對照，攜帶T等位基因的個體乳腺癌的發生風險顯著增高（OR=1.52，95%CI為1.37～1.94）。

2.5 XPC rs2228000位點多態性與乳腺癌患者臨床病理參數的相關性

ER陽性、病理類型為浸潤性導管癌的乳腺癌患者XPCrs2228000位點基因型分布分別與ER陰性、其他病理類型（浸潤性小葉癌、原位癌等）的患者比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；不同年齡、絕經狀態、PR表達、BRCA1基因表達的乳腺癌患者之間XPCrs2228000位點基因型分布差異均無統計學意義（P>0.05）。以其他病理類型（浸潤性小葉癌、原位癌等）為對照，CT+TT基因型的乳腺癌患者病理類型為浸潤性導管癌的風險增高（OR=2.3，95%CI為1.3～4.0）。以CC基因型為對照，CT+TT基因型的乳腺癌患者ER陽性的風險顯著增高（OR=1.9，95%CI為0.8～2.5）。見表3。

表3 不同臨床病理參數乳腺癌患者XPC rs2228000位點基因型分布比較

3 討論

XPC蛋白可與紫外切除修復蛋白RAD23B形成異二聚體復合物[4]，在核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）的早期發揮作用，是核苷酸切除修復系統的重要組成部分[5]。有研究結果顯示，XPC可與人源RAD23B重組蛋白相互作用，形成XPC-RAD23B復合物，激活p53抑癌基因，導致細胞周期阻滯，并在DNA識別和NER機制的啟動中發揮重要作用[6-7]。XPC基因結構功能障礙可導致DNA修復能力降低，目前已被證實與肝癌、食管癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的易感性相關[8-9]。

本研究結果顯示，乳腺癌組與正常對照組基因型（CC、CT、TT）和等位基因（C、T）的分布頻率差異均有統計學意義（P<0.01）；攜帶T等位基因的個體（CT+TT基因型）乳腺癌發生風險是攜帶C等位基因個體的1.52倍（OR=1.52，95%CI為1.37～1.94），攜帶CT和TT基因型的個體乳腺癌發生風險分別是攜帶CC基因型個體的1.36和2.44倍（OR值分別為1.36、2.44，95%CI分別為1.06～1.75、1.64～3.65）。提示XPCrs2228000（Ala499Val）位點多態性→T變異與乳腺癌發病有關。吳茵茵等[10]發現，XPCrs2228000位點多態性與乳腺癌發生無關，與本研究結果不一致。原因可能與地區、樣本數量、基因之間遺傳連鎖不平衡和缺少其他腫瘤患者XPCrs2228000位點多態性研究等有關。

有研究結果顯示，XPC基因會影響不同個體對DNA損傷的修復能力，從而影響患者惡性腫瘤的發生、激素水平和預后[11-12]。本研究結果顯示，XPCrs2228000位點基因型分布與ER陽性和病理分型有關；以其他病理類型（浸潤性小葉癌、原位癌等）為對照，CT+TT基因型個體發生浸潤性導管癌的風險增高（OR=2.3，95%CI為1.3～4.0），且含等位基因T的個體所占比例較高（71.7%）。浸潤性導管癌是乳腺癌的常見類型，表現為分化程度低，預后較差[13]。本研究結果還顯示，XPCrs2228000位點多態性與年齡、絕經狀態、PR、BRCA1等均無關（P>0.05），與文獻報道[14-15]一致。但因隨訪時間較短，人群地域分布較集中，可能存在與其他未知功能性SNP之間連鎖不平衡的偏差，本研究結果可能具有一定的局限性。

綜上所述，XPCrs2228000位點多態性與乳腺癌發病有一定關系。