大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞體外優(yōu)化培養(yǎng)方法的研究

朱一丹 吳翠萍 金越凡 殷善開 李春燕

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（上海 200233）

上海交通大學(xué)耳鼻咽喉研究所（上海 200233）

螺旋神經(jīng)元（Spiral Ganglion Neuron，SGN）一旦損傷很難再生。利用SG 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元有望為螺旋神經(jīng)元的修復(fù)提供新的方向[1]。然而，SG 干細(xì)胞培養(yǎng)仍有一些亟待解決的關(guān)鍵問題。既往研究[2-6]主要采用懸浮培養(yǎng)方法進行SG 干細(xì)胞球的培養(yǎng)。但懸浮培養(yǎng)方法存在一定缺陷，如干細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞不容易與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)接觸，后期會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及自噬等損傷；其次，內(nèi)部細(xì)胞無法進行形態(tài)上的直觀觀察。既往研究[7]發(fā)現(xiàn)，SG 干細(xì)胞與腦來源神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特性極其相似。而腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞多采用單層貼壁法培養(yǎng)，其優(yōu)點在于細(xì)胞單層貼壁，減少了早期接觸抑制，并且與培養(yǎng)基接觸完全，便于營養(yǎng)物質(zhì)的交換，更加有利于形態(tài)觀察和研究[8]。但SG干細(xì)胞的單層貼壁培養(yǎng)方式還鮮有研究報道。因此，本研究利用單層貼壁方式進行大鼠SG干細(xì)胞的培養(yǎng)，并首次與傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)法進行比較，對比兩種方法培養(yǎng)的SG干細(xì)胞形態(tài)、活性、純度、增殖能力及分化潛能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

新生1 天（Postnatal Day1，P1）的SD（Sprague-Dawley）由上海杰思捷實驗動物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號：20180004055508。

1.1.2 實驗試劑

改良Dulbecco 細(xì)胞培養(yǎng)液（Dulbecco’s odifiedm Eagle’s medium,DMEM／F12培養(yǎng)液;Invitrogen，美國），無血清培養(yǎng)液添加劑N2 和B27（Invitrogen，美國），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF；PeproTech，英國），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic-fibroblast growth factor，bFGF；PeproTech，英國），胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-I,IGF1; PeproTech，英國)，脫氧核糖核酸酶I(Deoxyribo、nucleaseI,DNaseI;Worthington,美國)，大豆胰蛋白酶抑制劑(oybean trypsin inhibitor；……