對(duì)CTAB法提取菠菜基因組DNA實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化設(shè)計(jì)

李巖，于海琳，馬曉彤，楊茜，張海燕 (菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，山東 菏澤 274000)

0 引言

菠菜［1］屬藜科菠菜屬，一年生草本植物，幼嫩新鮮的菠菜葉片富含DNA，各種雜質(zhì)含量較少且易去除，菠菜葉片在去除葉脈后纖維含量較少，可輕松研磨至勻漿糊狀，便于實(shí)驗(yàn)使用。

生物技術(shù)是21 世紀(jì)人類科技史中最令人矚目的高新技術(shù)，生物化學(xué)與分子生物學(xué)則是生物技術(shù)領(lǐng)域最重要和最基礎(chǔ)的學(xué)科，由于其專業(yè)的知識(shí)性、實(shí)踐性和應(yīng)用性，使其處于高校生命科學(xué)、生物技術(shù)、生物工程和臨床醫(yī)學(xué)等專業(yè)系列課程的核心位置[2]。DNA提取是分子生物學(xué)中重要的一門技術(shù)，DNA 的提取方法通常應(yīng)滿足以下幾個(gè)主要條件：(1)提取的DNA破損程度小，DNA 保持完整，從而保證后續(xù)電泳檢測(cè)容易獲得精確，重復(fù)性好的遷移條帶[3]；(2)所制備的DNA 具備理想的純度，避免蛋白質(zhì)、RNA 污染，以便于后續(xù)PCR 擴(kuò)增、酶切及質(zhì)粒重組等實(shí)驗(yàn)操作的完成；(3)提取過(guò)程要簡(jiǎn)便、省時(shí)盡可能降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，同時(shí)盡量避免使用危險(xiǎn)化學(xué)藥品，降低危險(xiǎn)性；(4)提取的DNA 的濃度高，以滿足對(duì)單株植物研究時(shí)所需要的DNA 的量。常用的DNA 提取方法有：CTAB 法［4］、SDS法［5］、高鹽低pH法［6］、尿素法［7］、異硫氰酸胍法［8］等。

CTAB 是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解各種膜系統(tǒng)，使細(xì)胞中的DNA 核蛋白釋放出來(lái)與CTAB 形成復(fù)合物，并使蛋白質(zhì)變性；在低鹽溶液中，通過(guò)離心可將CTAB-核酸復(fù)合物與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)分開(kāi)，使DNA 純化。CTAB 法是一種經(jīng)典的提取植物DNA 的方法，它有著操作步驟簡(jiǎn)便、使用試劑相對(duì)安全、操作時(shí)間較短、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，非常適合運(yùn)用于課堂教學(xué)中，做好這一實(shí)驗(yàn)可以讓學(xué)生更加直觀地觀察到DNA 提取物。但傳統(tǒng)的CTAB 提取法受人為操作因素和環(huán)境因素影響較大，存在RNA、多糖污染，DNA提純率不高等問(wèn)題。因此，需要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不斷地改進(jìn)和完善，以控制實(shí)驗(yàn)教學(xué)的進(jìn)程，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用品

主要試劑：菠菜、2×CTAB 提取緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、液氮、異丙醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)、異戊醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)、氯仿(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)、75%乙醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)、TE 緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

主要儀器：水浴鍋、離心機(jī)、移液槍、分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總體思路

合理控制實(shí)驗(yàn)時(shí)間、降低實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)性、提高DNA濃度及純度。

1.2.2 對(duì)照組A 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 稱取1.5 g 菠菜葉片于研缽中，加入適量液氮，輕輕搗碎葉片，待液氮快揮發(fā)完時(shí)，充分研磨成粉狀后轉(zhuǎn)移于2 mL 離心管中，加入600 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB 提取液，劇烈震蕩。(2)將離心管放入65 ℃水浴鍋中溫育20 min，期間顛倒混勻2～3 次。(3)將離心管取出后冷卻至室溫，加入等體積氯仿-異戊醇24∶1 的混合液，上下顛倒混勻后靜置10 min，10 000 r/min 離心5 min。(4)取上清500 μL 于新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻使樣品與有機(jī)溶劑充分接觸，室溫靜置10 min，10 000 r/min 離心5 min。(5)棄上清，加入800 μL 75%乙醇，顛倒離心管使沉淀懸浮，充分洗滌，10 000 r/min 離心2 min。(6) 棄上清，待乙醇完全揮發(fā)至離心管中無(wú)乙醇?xì)馕逗螅尤?00 μL TE 緩沖溶液充分溶解DNA，于4 ℃冰箱或-80 ℃冷藏箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［9］。

1.2.3 改良實(shí)驗(yàn)步驟(G組)

①酸堿指示劑顯色法：取等濃度的二種溶液各少許，分別向二試管內(nèi)滴入1-2滴酚酞，顏色均變紅，顏色較深的是N a2CO 3，顏色較淺的是N aH CO3；

(1)稱取1.5 g 菠菜葉片于研缽中，充分研磨至勻漿狀態(tài)，加入2.5 mL 65 ℃預(yù)熱的CTAB 提取液，充分混合均勻，取2 mL 懸濁液于離心管中。(2)將離心管放入65 ℃水浴中溫育20 min，期間顛倒混勻2 次。(3)將離心管取出后冷卻至室溫，10 000 r/min 離心5 min。(4)取1 mL 上清液于新的離心管中，加1 mL 氯仿-異戊醇24∶1 的混合液，上下顛倒混勻后，使樣品與有機(jī)溶劑充分接觸，靜置3 min，10 000 r/min 離心5 min。(5)取上清700 μL 于新的離心管中，加入5 μL RNase A，輕輕吹打混勻，置于55 ℃水浴中溫育30 min。(6) 待冷卻至室溫，加700 μL 異丙醇，顛倒混勻至樣品與有機(jī)溶劑充分接觸，室溫靜置10 min，用槍頭旋轉(zhuǎn)挑出離心管中的絮狀沉淀至另一離心管中。(7)加入800 μL 75%乙醇，上下顛倒離心管使沉淀懸浮，充分洗滌，重復(fù)三次。第三次洗滌后，10 000 r/min 離心2 min。(8)棄上清，待乙醇完全揮發(fā)至離心管中無(wú)乙醇?xì)馕逗螅尤?00 μL TE 緩沖溶液充分溶解DNA，于4 ℃冰箱或-80 ℃冷藏箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)樣品

OD260/OD280 是判斷 DNA 純度的重要指標(biāo)，比值在 1.6 到1.8 之間，表明 DNA 純度高，能夠滿足下游實(shí)驗(yàn)的要求；比值小于1.6 表明蛋白質(zhì)、酚類含量超標(biāo)；比值大于1.8，表明被 RNA 污染。

檢測(cè)OD230 是判斷樣品中存在污染物(如：碳水化合物、有機(jī)溶劑等)的依據(jù)，較純凈的核酸OD260/OD230 的比值在2.0～2.5 之間。

取溶解后的待測(cè)液30 μL，加1.97 mL 超純水，混勻后轉(zhuǎn)入石英比色皿，使用紫外分光光度法檢測(cè)DNA 的含量。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)步驟改進(jìn)方法及意義

舍棄液氮的使用，液氮溫度低，操作不當(dāng)容易被凍傷，舍棄其使用有效的降低了實(shí)驗(yàn)的危險(xiǎn)性。重新分配離心節(jié)點(diǎn)，增加65 ℃后離心，分離清液與未磨碎的葉片，沉淀蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，減少雜質(zhì)的污染，提高DNA 純度。 提高加入RNaseA 的反應(yīng)溫度至55 ℃左右，接近RNaseA 的最適溫度，既可以加快反應(yīng)速度，減少反應(yīng)時(shí)間，還可以避免溫度過(guò)高導(dǎo)致的DNA 結(jié)構(gòu)被破壞。在氯仿異戊醇混合液抽提后取清液加入RNaseA，反應(yīng)完成后，再加入異丙醇沉淀DNA，減少蛋白質(zhì)和RNA 的污染。使用挑出DNA 的方法代替離心［10］，減少離心時(shí)沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾，絮狀物結(jié)構(gòu)較為疏松，可以更好的被乙醇洗滌，有效的去除殘留的雜質(zhì)。使用75%乙醇清洗三次，使殘留的雜質(zhì)充分溶解于乙醇中，減少有機(jī)溶劑及多糖的污染。充分抑制核酸水解，增強(qiáng)DNA 分子柔韌性，防止DNA 斷裂，延長(zhǎng)DNA 的保存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分組如圖1 所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)分組圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 使用分光光度計(jì)檢測(cè)

D 組OD260/OD280 接 近1.8，DNA 純 度、濃 度較高且污染較少，證明使用RNaseA 可有效的提高DNA 的純度。

C 組與A 組比較得出挑出絮狀沉淀及乙醇洗滌三次的方法可以有效減少雜質(zhì)污染；B 組與C 組比較得出，在65 ℃溫育后離心可以更好的保證DNA 的純度及濃度。

由EF 兩組得出，不使用液氮對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響，可以舍棄液氮的使用。EF 兩組相較前六組數(shù)據(jù)較好，同時(shí)采用EF 組方法再加入RNaseA 之后(G組)，OD260/OD280 比值接近1.8，DNA 純度極高且濃度適宜如表1 所示。

表1 七組實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

故選擇G 組為最終實(shí)驗(yàn)流程。

2.2 DNA 檢測(cè)結(jié)果

采用G 組實(shí)驗(yàn)流程，進(jìn)行5 個(gè)樣品的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，該方法提取的DNA 的量較多，同時(shí)不含有雜質(zhì)，重復(fù)性好(如圖2 所示)。

圖2 改良CTAB 方法提取不同菠菜單株的DNA

2.3 PCR 的擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)5 個(gè)樣品進(jìn)行PCR 分析，都可以擴(kuò)增出比較清晰的條帶，并且條帶比較豐富(如圖3 所示)。改良的CTAB 方法可以較好的提取菠菜的DNA，并且這些DNA 可以滿足后續(xù)PCR 等實(shí)驗(yàn)的要求。

圖3 對(duì)5 個(gè)樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

為避免RNaseA 對(duì)DNA 的污染以及對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，大部分實(shí)驗(yàn)方法都是在異丙醇沉淀DNA 后重新溶解DNA 再加入RNaseA[11-12]，37 ℃水浴1 小時(shí)至數(shù)小時(shí)不等。再使用氯仿異丙醇抽提去蛋白，加入異丙醇沉淀DNA。這種方法耗時(shí)長(zhǎng)、步驟復(fù)雜，DNA丟失量大，提取濃度不高，不適合課堂教學(xué)及少量樣品的提取。

改進(jìn)方法在異丙醇之前加入RNaseA，使用挑出絮狀沉淀的方式代替離心，避免蛋白質(zhì)被離心至沉淀中，減少污染的可能。異丙醇沉淀核酸，不沉淀蛋白質(zhì)，可以減少去除RNaseA 的過(guò)程，減少實(shí)驗(yàn)步驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，增加DNA 的得率，提高DNA 的濃度。同時(shí)提高RNaseA 反應(yīng)溫度至55 ℃左右，接近RNaseA 的最適溫度，55 ℃不會(huì)導(dǎo)致DNA 結(jié)構(gòu)破壞，可以提高DNA 純度。升高溫度的同時(shí)可以減少反應(yīng)時(shí)間，55 ℃溫育30 min 與37 ℃溫育1 h 取得效果相似，可以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。

使用改良法提取菠菜葉片DNA，其濃度顯著提高，同時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)間適宜，減少了危險(xiǎn)化學(xué)藥品的使用，降低了蛋白質(zhì)、RNA 等物質(zhì)的污染，較好地調(diào)控了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，有效地提高了教學(xué)質(zhì)量和效率。可用于課堂教學(xué)、實(shí)驗(yàn)室提取DNA 等多種場(chǎng)景，可行性較高，推廣前景良好。