紫背萬年青提取物聯合吉非替尼對A549肺癌細胞的協同作用研究*

廖錦彬，張 倩，周妙姿，李楚文，周 瑩，張建軍

（1.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院），廣東 廣州 510095；2.廣州醫科大學，廣東 廣州 511436；3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006）

肺癌是最常見的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（nonsmall cell lung carcinoma, NSCLC）在肺癌中占比最大，其病死率也常居癌癥死因的首位[1]。當前，化療方案仍是肺癌治療的主要措施。吉非替尼（Gefi‐tinib,GEF）是經典的表皮生長因子受體酪氨酸激酶（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase,EGFR-TKI）抑制劑，臨床對NSCLC 肺癌患者具有顯著效果[2]。但由于EGFR 突變和腫瘤干細胞增多等原因，GEF 治療后往往出現腫瘤耐藥（multiple drug resistance, MDR），導致患者的預后和生存較差。因此，尋找高效安全的藥物用于EGFR-TKI輔助治療和克服耐藥性，目前臨床肺癌治療的迫切需要。

紫背萬年青（Rhoeo discolor（L’Herit.）Hance）屬于鴨跖草科植物，《全國中草藥匯編》記載，其以花葉入藥，具有清熱化痰，涼血止痢的功效；用于肺燥咳嗽，咯血，百日咳，淋巴結結核，痢疾，便血[3]。已有研究報道，紫背萬年青對于結腸癌、肝癌、前列腺癌的細胞增殖均有抑制作用，能減少癌前病灶數量和面積，拮抗二乙基亞硝胺對肝細胞的損害[4-6]。基于紫背萬年青對于多種癌細胞的抑制作用，及其臨床實踐基礎，本研究擬探討紫背萬年青提取物（Water ex‐tract from Rhoeo discolor,WER）與GEF 聯用對A549肺癌細胞的協同作用，并闡明其可能的分子機制，為紫背萬年青作為肺癌治療的輔助藥物或化療增敏劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人肺癌A549 細胞廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 紫背萬年青花水提液由廣東省第二中醫院制備（濃度：0.75g/ml 的生藥量，批次：202012001#）。DMEM 培 養 基（11965118）、RPMI-1640 培 養基（11875119）、胎牛 血 清（10100147）、0.25% 胰蛋白酶（25200056）、青霉素和鏈霉素（15140122）等購自Gibco 公司（美國）；吉非替尼（SML1657）購自Sigma 公司（美國）；抗體Bcl-2（4223）、Bax（2772）、p-PI3K（4228）、p-Akt（4060）和GAPDH（5174）等購 自CST 公司（美 國）；CCK-8（C0041）、Annexin V-FITC 細 胞凋 亡 檢測 試 劑盒（C1062S）、細胞周期檢測試劑盒（C1052）和PBS 購自上海碧云天公司（中國）；超敏ECL 化學發光試劑盒（G2020）購自武漢塞維爾生物科技（中國）。

1.3 儀器 5424R 型高速離心機（德國Eppendorf 公司）；OptiMair 型超凈工作臺（新加坡Esco 公司）；DM2500 型熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；MPR-440F 型低溫冰箱（日本Panasonic 公司）；Epoch 型全波長酶標儀（美國BioTek 公司）；Forma 310 系列CO2恒溫培養箱（美國Thermo 公司）；AI 800 型超靈敏多功能成像儀（美國GE 公司）；BD Accuri C6 流式細胞儀（美國BD公司）。

1.4 細胞培養A549 細胞培養在含1%鏈霉素-青霉素和10%胎牛血清的RMPI-1640 培養基中。A549細胞在37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。實驗取對數生長期細胞進行測試。

1.5 細胞活力檢測 取對數生長期的A549 細胞消化制成懸浮液，用RMPI-1640 培養基配制成8×104個/mL 的細胞混懸液，每孔按100 μL 接種于96 孔板，細胞貼壁24h 后，將培養基吸出，按需加入含有WER、GEF、WER+GEF 聯用藥物。實驗分別以PBS 作為空白溶劑對照。細胞孵育48h 后，采用CCK8 試劑盒檢測細胞活力。酶標儀測定450 nm 波長條件下吸光值（OD 值），并計算對細胞增值的抑制率（%）=1-（藥物OD值/空白對照OD值）×100和藥物的IC50。

1.6 Isobologram 法分析藥物相互作用 參照文獻方案[7]，依據CCK-8 的實驗結果，得出不同濃度WER、GEF 對A549 細胞的IC50，分別設為WIC50和GIC50，在橫縱坐標軸上繪制a 點（WIC50，0）和b 點（0，GIC50），連接a、b 兩點的直線作為相加線。根據CCK-8 實驗結果，求得不同濃度GEF 與WER（2.5mg/mL）聯用的GWIC50，繪制點c點（2.5，GWIC50）。若點c 在a b 連線下方，則表示兩藥聯用存在協同作用；若在連線上方，則表示兩藥聯用存在拮抗作用。

1.7 細胞凋亡檢測 取對數生長期的A549 細胞消化制成懸浮液，用RMPI-1640 培養基配制成1×106個/mL 的細胞混懸液，每孔按2 mL 接種于6 孔板，細胞貼壁24h 后，將培養基吸出，按需加入含有WER、GEF、WER+GEF 聯用的培養基。實驗分別以PBS 作為空白溶劑對照。細胞孵育48h 后，根據試劑盒說明，胰酶消化并收集細胞，分別加入Binding 溶液，AnnexinV-FITC 和PI 溶液，避光反應20 min，PBS 清洗，流式細胞儀檢測。

1.8 細胞周期檢測 如上2.4，藥物處理48h后，消化收集細胞，PBS 清洗、離心、重懸，加入預冷乙醇，4℃固定12h。然后，PBS清洗、離心、重懸細胞，按照試劑盒說明書，加入PI染液避光反應20 min，PBS清洗，流式細胞儀檢測。

1.9 Western blot 檢測相關蛋白 如上2.4，藥物處理48h 后，PBS 清洗細胞，加入細胞裂解液，收集細胞裂解液，冰上裂解30 min，高速離心20 min。收集上層清液，蛋白定量并調整蛋白濃度，加上樣緩沖液，并于100 ℃金屬浴變性10 min。蛋白樣品采用12%SDSPAGE 凝膠電泳，轉至PVDF 膜。室溫封閉1 h。隨后，加入相應一抗（按1：1000 稀釋），4℃孵育12h，TBST 清洗后加入二抗（按1：2000 稀釋），室溫下孵育2 h，TBST清洗后采用凝膠成像系統和ECL檢測試劑檢測分析蛋白表達。

1.10 數據分析 采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件進行數據處理和繪圖，數據以mean±SEM 表示，采用One-way ANOVA 進行數據分析，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 WER 與GEF 聯用協同抑制A549 細胞的細胞活力和細胞增殖 如圖1（A）所示，CCK-8 實驗結果表明，處理48h 以后，WER 在濃度低于2.5 mg/mL 時，A549 細胞的增殖仍保持在約90%以上；濃度提高到5～80 mg/mL 時，WER 呈現抑制A549 細胞增殖的作用，且具有濃度依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。計算得到，WER 抑制作用的IC50 值為14.98mg/mL。因此，我們選擇無明顯細胞毒性的2.5mg/mL 與不同濃度的GEF（1.25～40 μmol/L）聯用使用。如圖1（B）所示，給藥后，GEF 對A549 細胞的抑制IC50從13.36 μmol·L-1降低到7.48 μmol/L；其中，與GEF 單用比較，10.0 和20.00 μmol/L 劑量的GEF 與2.5 mg/mL WER 聯用后，A549 細胞的增殖率顯著降低，其差異均具有統計學意義（P＜0.05）。同時，如圖1（C）所示，Isobologram 分析結果提示，GEF 與2.5 mg/m WER 聯用對A549 細胞的IC50坐標c（2.5，7.48）落在a 點（WIC50，0）和b 點（0，GIC50）連線的下方，提示，GEF 與2.5 mg/mL WER 聯用后，對A549 細胞產生協同作用。因此，選擇低濃度、低毒性的7.5 μmol/L 的GEF與2.5 mg/mL 的WER聯用進行后續實驗研究。

圖1.WER與GEF聯用對A549細胞的細胞增殖和細胞活力的作用Fig.1 Effects of WER and GEF on cell viability and proliferation of A549 cells

2.2 WER 與GEF 聯用協同誘導A549 細胞的細胞凋亡 如圖2（A）所示，流式檢測結果發現，藥物處理后，對照、WER、GEF 和WER+GEF 組的A549 細胞凋亡率 分 別 為（6.55±0.92）% 、（9.49±1.18）% 、（21.36±2.37）%和（32.13±4.06）% ；與GEF 單 用 組 對 比，WER+GEF 聯用組，細胞凋亡率顯著升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）。隨后，如圖2（B 和C）所示，Western blot 檢測結果也發現，藥物處理后，與GEF單用組對比，WER+GEF 聯用組的Bax/Bcl-2 蛋白表達比例顯著上調，其差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2.WER與GEF 聯用對A549細胞的細胞凋亡的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on apoptosis of A549 cells

圖3.WER與GEF 聯用對A549細胞的細胞周期的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on cell cycle of A549 cells

2.3 WER 與GEF 聯用協同阻滯A549 細胞的細胞周期 如圖3 所示，流式檢測結果發現，藥物處理后，對照、WER、GEF 和WER+GEF 組的A549 細胞的G0/G1 期DNA 含量百分比平均值分別為29.51%、33.81%、44.28% 和61.57%。與GEF 單 用 對 比，WER+GEF聯用組的G0/G1期細胞比例明顯升高，細胞分裂周期停滯在G0/G1 期的能力更強，其差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 WER 與GEF 聯用協同 降低p-PI3K 和p-AKT 的蛋白水平 如圖4 所示，Western blot 檢測結果發現，藥物處理后，與GEF 單用對比，WER+GEF 聯用組細胞中PI3K/Akt 信號通路相關蛋白p-PI3K 和p-Akt的相對表達水平顯著降低，其差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖4.WER與GEF 聯用對A549細胞的p-PI3K和p-AKT蛋白表達的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on protein level of p-PI3 and p-AKT of A549 cells

3 討論

吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，在治療具有激活EGFR 突變的NSCLC 患者中療效顯著，可改善無進展生存期，但是GEF對野生型EGFR和KRAS突變患者不敏感，且大部分患者在接受GEF 治療一年左右會出現獲得性耐藥[8]。根據現代醫學對肺癌病理和臨床表現的認識，可將肺癌歸屬于“肺積”、“息賁”、“勞嗽”等中醫疾病范疇。《素問.咳論》中記載肺咳之狀，咳而喘息有音，甚則唾血”，肺所導致的咳之癥狀，具有咳而氣喘，呼吸有聲，甚至伴有唾血等特點，這與現代醫學中常見的肺癌臨床表現相似[9]。目前，國內對于紫背萬年青藥效的研究較少，僅見羅利瓊等[10]研究了其內生真菌類群的分布及抗菌、抗腫瘤活性，發現其內生真菌的發酵液有抗菌作用，并對肝癌細胞和乳腺癌細胞有抑制作用。國外的相關研究主要集中在墨西哥，Arriaga-Alba 等報道紫背萬年青醇提物具有抗氧化、抗誘變和抗基因毒性的作用，不具有致突變或基因毒性，其抗致突變性的機制可能為烷基化，修正ogt基因編碼的烷基鳥嘌呤轉移蛋白酶[4]。Rosales-Reyes等[5]研究表明紫背萬年青的水提物對肝癌大鼠有良好的保護作用，且藥物對肝臟沒有損害作用。García-Varela 報道[11]紫背萬年青具有抗微生物和抗真菌作用，其水、甲醇、乙醇提取物對結腸癌、肝癌、前列腺癌的細胞增殖均有抑制作用[6]，能減少癌前病灶數量和面積[5]，拮抗二乙基亞硝胺對肝細胞的損害。紫背萬年青提取物具有清熱化痰，涼血止痢的功效，用于肺燥咳嗽，咯血，百日咳，淋巴結結核[3]，這與現代醫學中常見的肺癌臨床表現相似。因此，研究紫背萬年青提取物與吉非替尼聯用對A549 肺癌細胞的協同抑制作用，并闡明其可能的分子作用機制，對于克服吉非替尼耐藥或者增加其對癌細胞的敏感性都具有重要的意義。

本研究通過CCK-8 實驗，發現紫背萬年青提取物WER（劑量大于10 mg/kg）和吉非替尼GEF（劑量大于5μmol/L）可以顯著抑制A549 細胞的細胞增殖和細胞活力，且呈劑量依賴性。低劑量的WER 或GEF 單獨給藥時對A549 細胞的增殖和活力抑制作用不明顯；但是WER 和GEF 兩藥聯用后則抑制效果顯著，通過Isobologram 分析也進一步明確低劑量WER 和GEF 聯用對A549 細胞的增殖和活力具有協同抑制作用。流式檢測結果發現，WER 和GEF 聯用可以促進A549 細胞的細胞凋亡。進一步的蛋白表達檢測提示，WER 和GEF 聯用可以干預凋亡調控蛋白Bcl-2 家族的表達水平；WER 和GEF 聯用促進促凋亡蛋白Bax 的表達，降低抑制凋亡蛋白Bcl-2 的表達，提示兩藥聯用后促進A549 的細胞凋。同時，流式檢測結果也發現WER+GEF 聯用組的G0/G1 期細胞比例明顯升高，細胞分裂周期停滯在G0/G1 期的能力更強。因此，WER+GEF 聯合用藥后，對細胞增殖、細胞凋亡和細胞G0/G1期阻滯，起到協同作用。

PI3K/Akt 信號通路體系是細胞生存和發育的重要通路。已有研究證實，激活PI3K/Akt 通路是腫瘤耐藥性形成的因素之一[7]。肺癌的多種生長因子主要通過PI3K/Akt 信號轉導通路發揮作用，腫瘤細胞經化療藥物作用后增加了Akt 磷酸化水平，并激活PI3K/Akt 信號通路，活化的Akt 進一步激活其下游因子使癌細胞對化療藥物產生耐藥性[7,12]。本研究結果表明，WER+GEF 聯用后可以顯著降低PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化水平；結果提示，兩藥聯用可協同抑制PI3K/Akt 通路的激活，從而增強藥物對細胞的作用。

綜上所述，WER 和GEF 聯合用藥后起到協同作用，顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和增加細胞G0/G1期阻滯，其可能的機制與PI3K/Akt信號通路的抑制作用密切相關。本研究為紫背萬年青作為肺癌治療的輔助藥物或化療增敏劑的提供新的研究資料。