超高效液相色譜- 串聯質譜法測定魚肉中4 種四環素類抗生素

王雪蓉，楊燕紅，楊 麗，陳大鵬，馬義虔

貴州省產品質量檢驗檢測院，貴陽 550016

四環素類(tetracyclines, TCs)藥物是由放線菌產生的一類基本骨架為并四苯環的廣譜抗生素[1-2]。四環素類藥物在水產養殖領域具有廣泛的應用[3]，它對病原菌有抑制作用，也能促進水產動物快速生長。由于缺乏科學指導，導致濫用現象十分嚴重，在水產養殖過程中會有20%～30%的四環素類藥物被魚類吸收，從而誘導體內致病微生物產生抗性基因(antibiotic re sistance genes，ARG)，當抗性基因通過食物鏈方式進入人體后會對健康構成威脅[4-6]。四環素類抗生素是保障動物和人類健康的重要武器，如果長期食用含四環素類抗生素殘留的水產品，可能會產生致癌致畸致突變、過敏反應和降低人體免疫能力的危害等[7-8]。因此，世界各國對水產品中的獸藥殘留限量做了嚴格規定，我國規定魚組織（皮和肉）中土霉素、金霉素和四環素的最大殘留量為200 μg/kg[9]。

四環素類抗生素的檢測方法有：微生物法[10]、免疫分析法[11]、分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]和液質聯用法[14-17]等。微生物法只能測定四環素類抗生素總量，酶聯免疫法只能測定個別四環素類抗生素[13,18]，高效液相色譜-串聯質譜法靈敏度高、準確度高，且儀器分析時間短，適用于多種抗生素藥物殘留的同時分析。本研究使用Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取，Oasis HLB 固相萃取小柱凈化，結合UPLCMS/MS 測定魚中4 種四環素類（四環素、金霉素、土霉素、強力霉素）抗生素的方法，為魚肉中四環素類抗生素的測定提供一種準確、可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

AcQuity H/Xevo TQ-XS 液相色譜質譜聯用儀，Waters 公司；H1850 離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；MultiReax 渦旋振蕩器，Heielolph公司；Chorusl 超純水系統，英國Elga；ME1002TE 電子天平，德國Mettler。

1.2 材料與試劑

檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、醋酸鉛、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、乙腈均購買于國藥試劑。

標準品：鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環素、鹽酸多西環素，純度均≥95%。

Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液(0.1 mol/L)：取乙二胺四乙酸二鈉37.2 g、檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g，加水溶解并定容至1 000 mL，用HCl 或NaOH調pH 值至4.0±0.05。醋酸鉛溶液(20.0 g/L)：取醋酸鉛20.0 g，加水溶解并定容至1 000 mL。甲醇-乙酸乙酯：取甲醇10 mL、乙酸乙酯90 mL，搖勻。0.1%甲酸溶液-乙腈：取0.1%甲酸溶液90 mL、乙腈10 mL，搖勻。

1.3 試驗方法

1）標準溶液的配制。①4 種抗生素單標儲備液配制：準確稱取4 種抗生素標準品用甲醇定容至10 mL，配制成質量濃度為1 000.0 μg/mL 單標儲備液。

②4 種抗生素混標中間液配制：分別移取0.1 mL 4 種四環素類抗生素儲備液于容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，配制成10 μg/mL 混標中間液。

③4 種抗生素混標使用液配制：分別吸取0、2、5、10、20、50、100 μL 混標中間液，用空白基質溶液定容至10 mL，配制0、2、5、10、20、50、100 ng/mL 的混標使用液。

2）樣品前處理。

①樣品制備：魚肉樣品切碎，用均質儀搗碎均質，混勻后，四分法取樣。

②提取：稱量2 g 樣品于離心管中，加Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液6 mL、醋酸鉛溶液2 mL，渦旋混勻2 min，超聲提取20 min，4 ℃條件下8 000 r/min 離心5 min，取上清液。重復提取2 次，合并3次提取液。

③凈化：Oasis HLB 固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL 進行活化，取提取液10.0 mL 過柱，過完后用水、甲醇溶液各5 mL 淋洗小柱，棄去流出液，減壓抽干5 min。甲醇-乙酸乙酯5 mL 洗脫，洗脫液于40 ℃下氮氣吹至近干，加0.1%甲酸溶液-乙腈1.0 mL 溶解殘渣，渦旋混勻，過0.22 μm 濾膜，待測。

3）液相條件。色譜柱：ACQUITY UPLCRBEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速：0.35 mL/min；進樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；流動相：A 為0.1%甲酸水，B 為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 四環素類的流動相梯度洗脫

4）質譜條件。電離方式：電噴霧ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)模式；霧化氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：150 L/h；脫溶劑氣流速：200 L/h；毛細管電壓：4 200 V；離子源溫度：350 ℃；質譜條件見表2。

表2 質譜條件

2 結果與分析

2.1 線性方程和檢出限

本試驗采用添加空白基質溶液對4 種混標溶液進行定量測定。4 種四環素類混合標準溶液的定量離子MRM 色譜見圖1。

圖1 四環素類抗生素混合標準溶液的MRM 色譜（質量濃度10 ng/mL）

由表3 可知：4 種四環素類（四環素、金霉素、土霉素、強力霉素）抗生素在0～100 ng/mL 范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999。

表3 四環素類抗生素線性方程和相關系數

2.2 方法回收率和精密度

選取陰性的魚肉樣品，分別加入3 個水平（5.0、10.0、50.0 μg/kg）的四環素類抗生素標準溶液，按照本文“1.3”中的條件進行加標回收試驗，結果見表4。由表4 可知：多西環素、土霉素、四環素、金霉素的回收率范圍分別為85.6%～97.7%、89.3%～93.0%、84.2%～97.1%、87.6%～94.2%，精密度RSD 范圍分別為0.9%～1.3% 、0.2%～1.7% 、0.4% ～7.5% 、1.0% ～1.2%。研究表明，4 種四環素類抗生素回收率均在70%～120%，相對標準偏差RSD≤10%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》對回收率60%～120%、精密度＜15%的要求，說明該方法具有較好的準確性和穩定性，可以用于魚肉中四環素類抗生素的測定。

表4 四環素類抗生素的回收率和精密度

2.3 方法檢出限

方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)為產生3 倍和10 倍信噪比(S/N)時磺胺類化合物的質量濃度。四環素類抗生素檢出限為5.0 μg/kg，定量限為10.0 μg/kg，而國標GB 31656.11—2021《食品安全國家標準 水產品中土霉素、四環素、金霉素和多西環素殘留量的測定》中多西環素、土霉素、四環素、金霉素的檢測限分別為20.0、10.0、10.0、20.0 μg/kg，定量限分別為40.0、20.0、20.0、40.0 μg/kg，表明該方法的4 種四環素類抗生素的檢出限和定量限均低于國標給定值，可以測定出更低濃度的含四環素類抗生素樣品。

2.4 樣品測定

2022 年采用該方法對45 批次魚肉樣品進行測定，檢出四環素3 批次和金霉素4 批次，含量范圍分別為10.20～30.34、15.60～41.87 μg/kg，GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規定四環素和金霉素限量值為100 μg/kg，所有樣品均在限量值范圍內，說明這45 批次魚肉樣品不會對消費者身體健康帶來危害。

3 結 論

魚肉中四環素類藥物的檢測對人類的健康非常重要，本研究建立了魚肉中4 種四環素類抗生素（四環素、金霉素、土霉素、強力霉素）的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。以Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取、Oasis HLB 固相萃取小柱凈化，通過加標回收率試驗表明：回收率均在70%～120%、相對標準偏差RSD≤10%，4 種四環素類抗生素檢出限均為5.0 μg/kg，定量限為10.0 μg/kg，滿足GB/T 27404—2008 對回收率60%～120%、精密度＜15%的要求，說明該方法靈敏度高、準確性高和穩定性好，可用于魚肉中4 種四環素類藥物的測定。