辣椒褐腐病病原菌拮抗菌篩選及生防效果

趙春燕 安良聰 趙秋玲 孫中濤

（1.聊城市茌平區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 山東聊城 252100；2.山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 山東泰安 271000；3.聊城市茌平區(qū)信發(fā)集團 山東聊城 252100）

關鍵字：辣椒褐腐病；拮抗菌；貝萊斯芽孢桿菌；生物防治

辣椒現(xiàn)已成為是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一[1-2]。 辣椒褐腐病是辣椒生長過程中的一種重要病害，發(fā)病輕的地塊減產(chǎn)10%，發(fā)病嚴重的地塊減產(chǎn)30%。 褐腐病在辣椒整個生長期均可染病，導致植株枯萎、死亡，果實腐爛、干癟[3]，該病主要危害花器和果實，發(fā)病癥狀表現(xiàn)為花器染病后變褐腐爛，果實染病變褐軟爛[4]，嚴重影響干鮮椒的產(chǎn)量和商品性。

化學防治能夠在短時間內(nèi)控制作物病情， 但長期使用化學防治方法不僅污染環(huán)境， 也不利于人類健康。 生物防治具有環(huán)境污染小、安全性高等優(yōu)點，同時植物不易產(chǎn)生抗藥性，是很好的防治方法[5]，不僅能夠有效控制病原菌， 減輕農(nóng)作物所受病原菌的傷害[6]，最重要的是可以避免化學防治的眾多弊端，因此作物病害生物防治成為重點研究方向[7-8]。 生防菌在生物防治技術中有著重要地位，芽孢桿菌、綠膿桿菌、假單胞菌等各種細菌、放線菌、真菌均可用于植物的病害防治。 國內(nèi)外在利用生防菌對植物病害進行防治方面都取得了一定的進展。 例如，海洋芽孢桿菌發(fā)酵液對黃瓜灰霉病的盆栽防效為83.23%[9]；木霉菌在植物病害的生物防治中被廣泛應用[10]。山東農(nóng)業(yè)大學景芳等研制的木霉菌劑能夠有效防治黃瓜菌核病、油菜根腐病等多種病害[11-12]，但關于辣椒褐腐病生防菌的研究較少。

試驗中篩選得到的貝萊斯芽孢桿菌是一種重要的生防資源，在生物制劑研制中被廣泛應用，已被用于治療多種作物的褐腐病。 例如，陳少先分離得到貝萊斯芽孢桿菌zk1 對鷹嘴桃腐敗真菌膠孢炭疽菌和哈茨木霉的抑菌率分別為57.59%和83.16%[13]，貝萊斯芽孢桿菌HNt7 能治療或預防梨果實腐爛病，防效在70.76%以上[14]。 本試驗旨在篩選出辣椒褐腐病的拮抗菌，探索辣椒褐腐病的生物防治方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 試驗中的辣椒褐腐病病原菌角擔菌 （Ceratobasidium ramicola）BING-15、 胡蘿卜軟腐歐文氏菌（胡蘿卜軟腐變種）（E. carafavoratear，saro-Eoriora）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、 辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）由山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基配制及病原菌活化 PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、 葡萄糖20 g/L、 瓊脂15～20 g/L、pH 7.0，121℃高壓滅菌20 min）；NA 培養(yǎng)基 （牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、 瓊脂15～20 g/L、 蒸餾水pH 7.0，121℃高壓滅菌20 min）；高氏一號培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g/L、硝酸鉀1 g/L、NaCl 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、Fe2（SO4）30.01 g/L、瓊脂20 g/L、pH7.0、蒸餾水1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min）。

室內(nèi)盆栽供試材料： 線辣椒幼苗， 品種為帝王336，由濰坊壽光鑫青種苗公司提供。 供試土壤為山東佐田氏生物科技有限公司實驗田的土壤。

病原菌活化： 將病原菌BING-15 菌種接種到新的PDA 培養(yǎng)基上，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。

1.2 拮抗菌的篩選

1.2.1 拮抗菌的分離 供試土壤采集地點采集于德州、東營、濟南、泰山4 地（表1）。 去除表層帶有雜質(zhì)的土壤，采取5～10 cm 深處的土樣約200 g。

表1 土樣采集

1.2.2 拮抗菌的篩選 對拮抗菌的分離采用稀釋平板法， 將采集的土樣過篩處理， 稱取10 g 土樣放入盛有玻璃珠和90 mL 無菌水的三角瓶中， 在37℃、170 r/min 搖床下震蕩30 min[15]。 將液體混合均勻后進行稀釋，分別吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液100 uL在PDA 平板、LB 平板、 高氏一號培養(yǎng)基平板上涂布均勻，PDA 平板、高氏一號培養(yǎng)基平板在28℃恒溫箱培養(yǎng)46 h，LB 平板在37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h[16-17]，分離純化不同種類的菌種，驗證其是否有拮抗效果。

通過平板對峙法篩選拮抗菌。 辣椒褐腐病原菌活化后，將餅菌（5 mm）置于新PDA 平板中心[18]，培養(yǎng)12 h 后在距菌餅2 cm 處按十字方向放置4 塊拮抗菌，在28℃下恒溫培養(yǎng)72 h，測量拮抗菌株與病原菌形成抑菌圈的直徑[19]，每組設3 個重復。

抑菌圈直徑（D）=2×抑菌間隙寬度+拮抗菌菌落直徑（d）

1.3 拮抗菌的鑒定

1.3.1 菌落及菌體形態(tài)觀察 觀察拮抗菌培養(yǎng)基的顏色及菌落是否光滑、透明度、形狀、大小、是否產(chǎn)芽孢，并對其進行革蘭氏染色。

1.3.2 生理生化分析 參照 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對拮抗菌進行革蘭氏染色、檸檬酸鹽試驗、接觸酶試驗、甲基紅試驗、淀粉水解試驗、芽孢染色、V-P試驗、吲哚試驗等測定生理生化指標。

1.3.3 16S rDNA 測序分析 把分離純化的菌株落送至青島睿博興科生物技術有限公司進行16S rDNA測序，將測序結果在NCBI 網(wǎng)站中進行BLAST 比對，選擇比對結果中同源性相近的不同菌種序列， 利用MEGA 5.5 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行同源性分析[20]。

1.4 拮抗菌驗證試驗

拮抗菌接種在LB 液體培養(yǎng)基中28℃、170 r/min搖床震蕩培養(yǎng)72 h 制成懸浮液；病原菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中28℃、170 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)72 h 制成懸浮液。 一組施加病原菌懸浮液500 mL+無菌水500 mL， 另一組施加病原菌懸浮液500 mL +拮抗菌發(fā)酵液500 mL，在辣椒開花期進行試驗，25 d 后將辣椒植株挖出，清洗干凈，觀察辣椒植株情況。

對采摘的新鮮辣椒葉片用75%酒精消毒后再用無菌水沖洗3 次擦干備用。 一組在無菌水中浸泡2 h后接種病原菌菌塊，另一組在拮抗菌液中浸泡2 h 后接種病原菌菌塊， 在28℃恒溫箱培養(yǎng)3 d 期間保持葉面濕潤。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013 進行數(shù)據(jù)處理， 采用Duncan’s法進行方差析（SPSS 22.0）。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選鑒定

2.1.1 拮抗菌株的篩選結果 利用稀釋平板法在采集的土樣中分離純化到細菌25 株和放線菌2 株，通過平板對峙試驗篩選到8 株對辣椒褐腐病菌拮抗效果較好的菌株， 經(jīng)測算其中JK-1 抑菌圈直徑最大，表明菌株JK-1 拮抗效果最好（圖1、表2）。

圖1 不同菌株對辣椒褐腐病菌的拮抗作用

表2 8 株拮抗菌對辣椒褐腐病菌的抑菌能力

2.1.2 拮抗菌菌株鑒定 拮抗菌JK-1 在LB 培養(yǎng)基三區(qū)劃線，在37℃下培養(yǎng)12 h，菌落直徑為3～5 mm，呈圓形，表面中心呈透明狀隆起，邊緣干癟；JK-1 菌株革蘭氏染色呈陽性，菌體短桿狀，芽孢為綠色、橢圓形， 在LB 平板上呈乳白色，PDA 平板上菌落呈橘黃色，用接種環(huán)挑起黏稠狀物質(zhì)（圖2）。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌JK-1 形態(tài)特征

2.1.3 拮抗菌生理生化鑒定 根據(jù) 《伯杰細菌系統(tǒng)鑒定手冊》、 菌株生理生化試驗及菌落菌體形態(tài)觀察， 初步判定該菌株為芽孢桿菌屬 （Bacillusspp.），JK-1 菌株的生理生化特征見表3。

表3 菌株JK-1 的生理生化特征

2.1.4 拮抗菌菌株測序分析 測序得到的JK-1 菌株基因序列進行BLAST 分析， 使用MEGA 11.0 軟件，結合16S rDNA 序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)JK-1菌株與芽孢桿菌屬聚集在一起（圖3）， JK-1 菌株與貝萊斯芽孢桿菌有非常高的同源性。 通過JK-1 菌株菌落及菌體形態(tài)觀察、 生理生化試驗， 結合測序結果，鑒定菌株JK-1 為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA 基因序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 拮抗菌抗菌譜試驗分析

為了研究JK-1 菌株的生防能力， 通過平板對峙試驗測定了JK-1 菌株對角擔菌、 胡蘿卜軟腐歐文氏菌（胡蘿卜軟腐變種）、尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉菌、立枯絲核菌、腐皮鐮刀菌菌絲的抑制情況， 結果顯示， JK-1 菌株對6 種病原菌均有一定的抑制作用， 其中對角擔菌、 尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌抑制效果較明顯（表4、圖4）。

圖4 菌株JK-1 抗菌譜試驗結果

表4 拮抗菌JK-1 對病原真菌的拮抗效果

2.3 拮抗菌防治效果

由圖5 可知， 浸泡無菌水接種病原菌的葉片產(chǎn)生水浸狀病斑，慢慢擴散到整個葉面，最后全葉變褐枯萎，經(jīng)JK-1 發(fā)酵液浸泡葉片未發(fā)未發(fā)病或輕微染病， 澆灌拮抗菌的植株比澆灌清水的植株莖稈粗壯高大、根系發(fā)達，試驗表明拮抗菌JK-1 對辣椒褐腐病有很好防治效果。

圖5 拮抗菌JK-1 處理后辣椒褐腐病對辣椒根部和葉片的影響

3 討論與結論

貝萊斯芽孢桿菌在自然界中廣泛存在， 人們陸續(xù)從水、土壤、動物腸道、發(fā)酵食品等處分離得到該菌種[21]，貝萊斯芽孢桿菌是目前研究生防菌的熱點之一，能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，具有良好的生物學功能，能防治植物真菌，在促進植物生長方面也具有重要作用。

通過稀釋平板法、平板對峙法方法篩選拮抗菌，其中菌株JK-1 抑菌效果最好， 通過觀察菌株菌落、生理特檢驗性，結合16S rDNA 測序和構建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定JK-1 為貝萊斯芽孢桿菌，此菌株貝萊斯芽孢桿菌JK-1 菌株對辣椒褐腐病病原菌有明顯抑制作用，且JK-1 菌株具有廣譜抑菌活性，對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉菌、胡蘿卜軟腐歐式菌均有抑制效果。 綜上所述，本研究在根際土壤篩選到的對辣椒褐腐病病原菌有顯著拮抗作用的菌株JK-1 對辣椒褐腐病病原菌有較強的防治效果， 具有良好的應用發(fā)展前景和生防潛能， 這將為此生防菌劑的開發(fā)及應用提供重要依據(jù)。