巨噬細胞極化及其與鄰近細胞串擾在肝細胞癌中的作用

蘇會吉, 顏耿杰, 陳含笑, 班少群, 韋艾凌,, 毛德文, 龍富立

1 廣西中醫藥大學研究生院, 南寧 530200; 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病二區, 南寧 530023

巨噬細胞是單核吞噬系統的重要組成部分,其在細胞因子刺激下極化為兩種不同的類型,分別是具有促炎、腫瘤抑制作用的M1型和具有抗炎性、腫瘤支持的M2型。浸潤腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)的巨噬細胞,被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM),已逐漸受到關注[1]。TAM通常是M2型抗炎免疫細胞,與惡性疾病進展、耐藥性及預后不良有關。肝細胞癌(HCC)占原發性肝癌的75%～85%[2]。在早期HCC發展期間,由促炎巨噬細胞和肝星狀細胞驅動的纖維蛋白炎癥為腫瘤發生提供微環境;而在晚期HCC中,巨噬細胞極化為免疫抑制性TAM支持腫瘤進展。癌癥治療已經進入靶向免疫治療的時代,不再限于傳統的放化療或手術切除[3]。因此,通過調節TAM尋求HCC的新型治療策略是非常必要的。

TME是導致腫瘤細胞持續不受控制地生長、轉移、免疫抑制和耐藥性的原因,靶向TME是一種潛在治療癌癥的新方法。TME內含多種元素,包括基質細胞、成纖維細胞、內皮細胞、免疫細胞以及宿主與腫瘤細胞分泌的各種細胞因子、趨化因子和其他因素[4],這些細胞間串擾可決定腫瘤的發展方向,尤其是腫瘤細胞串擾。TME中的巨噬細胞,即TAM,是大多數腫瘤中的主要浸潤性免疫細胞群,具有中樞免疫調節作用,通過抑制抗腫瘤免疫反應建立一個促炎癥和促腫瘤的環境,在HCC的發病機制中起著至關重要的作用[5]。TAM成為癌癥免疫治療策略一個新的目標。

1 巨噬細胞極化及其在TME中的作用

1.1 巨噬細胞極化與TME 巨噬細胞在肝臟中極為豐富,參與宿主防御、傷口愈合和免疫調節,主要分為肝臟駐留的巨噬細胞(稱為Kupffer細胞)和骨髓衍生的巨噬細胞(稱為單核細胞衍生的巨噬細胞)。在正常肝臟中,巨噬細胞主要以Kupffer細胞形式存在。在HCC進展期間,Kupffer細胞受到促腫瘤因子的刺激后經歷表型轉換成為TAM。巨噬細胞極化是由局部細胞微環境中的微生物劑和細胞因子所誘導。由于巨噬細胞的可塑性,未分化的巨噬細胞(M0)極化為兩種類型:經典活化巨噬細胞(M1)和交替活化巨噬細胞(M2)[6],如圖1所示。M1的誘導劑主要包括脂多糖(LPS)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α);而M2極化受2型輔助性T淋巴細胞(Th2)因子的影響,如白細胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子β(TGF-β)、糖皮質激素、免疫復合物、Toll樣受體(TLR)或IL-1R配體以及白血病抑制因子激素[7]。此外,M2型可分為4種亞組(M2a、M2b、M2c和M2d)[8]。M1型巨噬細胞是具有抗炎和免疫調節作用的高效效應細胞,M2型巨噬細胞則參與促炎過程、適應性Th1免疫、組織重塑和修復以及腫瘤進展。M1和M2表型可以根據各種環境不同細胞因子的刺激進行相互轉化并改變其生理功能。有研究[8]示肝癌細胞分泌的因子可觸發TAM中的M2型巨噬細胞極化,表明在HCC中TAM可表達出M2樣特性。

TAM是TME中最豐富的浸潤性免疫細胞,主要分為2個亞組:定居在特定組織和器官中的源自胚胎造血祖細胞組織駐留的TAM以及起源于外周循環中的循環單核細胞衍生的TAM。這些細胞被募集到TME中迅速分化為巨噬細胞,TME內由宿主或腫瘤細胞分泌或表達多種調節因子也參與單核細胞衍生的TAM募集和分化。單核細胞衍生的TAM被視為經典的TAM,并通過各種信號通路刺激腫瘤細胞的增殖和生存,在腫瘤發展中發揮重要作用。由于對巨噬細胞的起源和其自身缺乏更深入地了解,組織駐留的TAM在腫瘤發生中的作用和分子機制仍有待進一步研究[5]。

圖1 巨噬細胞極化及其特性

TME是參與腫瘤和免疫細胞募集構建促進耐藥性的致瘤環境[9],TAM極化受到癌癥類型、腫瘤階段、臨床干預影響,尤其是TME的調節。TME中的細胞因子和分子,如IFN-γ、TNF-α、單酰甘油脂酶和CD68可誘導M1-TAM極化,具有相應的抗腫瘤活性[10]。缺氧誘導因子、外周大麻CB2受體、CD163、信號轉導和磷酸化的轉錄激活因子(STAT)以及精氨酸酶主要負責M2-TAM極性和腫瘤進展[11]。M1-TAM是抑制腫瘤的主要殺手細胞,而M2-TAM的作用是促進腫瘤的發生發展。此外,在特殊的TME中,極化TAM通常與其他免疫細胞,如自然殺傷細胞、B淋巴細胞、CD8細胞、γδT淋巴細胞或CD4CD25Foxp3調節性T淋巴細胞(Treg)相互作用,導致腫瘤的抑制或發展[12]。腫瘤組織中高水平的M1-TAM預示著癌癥患者有更好的生存結果,而M2-TAM富集預示著預后不良[13]。M2-TAM浸潤越多,通過誘導腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤轉移和上皮-間質轉化,患者臨床預后越差。針對TAM,尤其是M2-TAM新興治療策略研究中,通過抑制單核細胞/巨噬細胞的招募或激活,可直接消除巨噬細胞,或調節巨噬細胞從M2到M1狀態的極化,以清除癌細胞或進行代謝重編程[14]。

1.2 巨噬細胞極化在HCC微環境中的作用 TME是HCC中巨噬細胞極化的驅動力,導致具有免疫抑制特性巨噬細胞產生。TME中酸性pH值過高可誘導調節性TAM增強腫瘤免疫逃避的能力[15]。在HCC小鼠實驗模型中發現Wnt/β-連環蛋白信號驅動巨噬細胞向M2表型分化,并在c-Myc驅動的M2極化巨噬細胞中高度表達,表明抑制HCC中Wnt蛋白分泌通過調節小鼠腫瘤的免疫微環境來防止肝臟腫瘤生長[14]。在人HCC活檢組織的M2型TAM中也觀察到β-連環蛋白的積累[16]。TLR4激發的先天性單核細胞炎癥是HCC中IL-21+Tfh-like細胞誘導的必要條件,STAT1和STAT3的激活是Tfh-like細胞極化的關鍵,Tfh-like細胞在IL-21/IFN-γ依賴性信號通路中發生極化,誘導漿細胞分化,為促腫瘤性M2型巨噬細胞極化和癌癥進展創造條件[17]。脊椎蛋白2及其整合素受體α4β1作為巨噬細胞吞噬的蛋白,導致抗腫瘤免疫反應,在HCC微環境招募M1-TAM亞型的過程中發揮重要作用[18]。在注射癌基因致HCC小鼠模型中,Kupffer細胞表達的miR-206通過產生趨化因子配體2(CCL2)驅動M1極化,并招募CD8+T淋巴細胞[19]。IL-6/STAT3信號通路可以調節M1/M2型巨噬細胞的極化,抗IL-6可降低細胞活力和耐藥性,抑制細胞侵襲和遷移,誘導與M1或M2型巨噬細胞共培養的HCC細胞凋亡,抑制腫瘤形成和肺部轉移[20]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一種由間充質樣HCC細胞表達的蛋白。TGF-β在HCC中招募M2型巨噬細胞,而M2型巨噬細胞又被CTGF極化。TGF-β作為螯合劑,從外周血中招募單核細胞,而CTGF作為轉化劑,將單核細胞極化為M2型巨噬細胞,刺激腫瘤的生長,并分泌CCL18促進HCC細胞遷移[21]。在HCC腫瘤細胞中的程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)在巨噬細胞中以高水平表達,其M1表型被激活,沒有表現出完整的M2極化,這表明TAM表型可能無法使用經典的M1/M2模型簡單地定義。

2 巨噬細胞在HCC中的作用

巨噬細胞在參與HCC的發生發展過程中至關重要。IL-1β刺激M2細胞的促遷移作用,脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)負責IL-1β的上調分泌,其依賴于活性氧和NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體,表明M2細胞通過FAO依賴性過程增加了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲[22]。趨化因子CCL2 /趨化因子受體CCR2依賴性信號傳導機制參與HCC發展過程。在肝癌小鼠模型中,CCR2+骨髓細胞顯示出雙重功能。在癌細胞分化時,CCR2+骨髓細胞通過清除衰老肝細胞抑制腫瘤發展;當進展為HCC時,抑制未成熟CCR2+骨髓細胞浸潤,使自然殺傷細胞失活,促進腫瘤生長[23]。CCL2/CCR2軸的抑制導致單核細胞募集阻滯、M2極化,從而抑制CD8+T淋巴細胞介導的抗腫瘤反應。缺氧TME中腫瘤細胞與TAM之間的缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)/IL-1β反饋回路導致癌細胞上皮-間充質轉變和體外轉移。研究[24]發現,HIF-1α的穩定性增加,TAM在中度缺氧條件下分泌IL-1β增多,HCC細胞的壞死碎片通過TLR4/TRIF/NF-κB信號傳導促進了具有M2表型的TAM釋放IL-1β。有研究[25]證明浸潤M2-TAM在TME中明顯升高,產生IL-17,并且在奧沙利鉑治療后增強。IL-17A從淋巴內皮細胞協同分泌,通過肝癌干細胞PD-L1的上調促進腫瘤發生[26]。

M2巨噬細胞與HCC的“超級免疫反應”亞型有關,參與不良預后[27]。由于M-CSF/CSF1R介導的TAM侵襲,miR-148b缺乏會促進HCC的生長和轉移,而HCC患者的miR-148b水平降低和TAM浸潤增加與預后惡化有關[28]。Li等[29]研究發現,SIRT4在HCC巨噬細胞中表達降低,導致FAO-PPARδ-STAT3依賴性信號通路中M2的極化,SIRT4的沉默增加TAM中IL-6的產生,導致HCC腫瘤周圍組織中IL-10的產生增加,致使M1巨噬細胞凋亡,表明SIRT4的下調與巨噬細胞侵襲的增加和HCC周圍組織中M2-TAM的增加有關。因此,HCC患者的生存率低。高遷移率族蛋白B1的表達與IL-1β、IFN-γ和TNF-α分泌增加有關,并且與HCC患者的腫瘤周圍TAM浸潤和預后不良相關。研究[30]表明,腫瘤周圍高遷移率族蛋白B1高表達和TAM數量與腫瘤大小及BCLC分期呈正相關,是HCC患者總生存期和無復發生存期的獨立預后因素。CD206在HCC組織中的表達量高于癌周組織,而GdCl3治療則通過下調M2型巨噬細胞中CD206的表達,抑制HCC在體外和體內的惡性潛能,表明CD206作為HCC預后生物標志物的潛在意義[31]。

Wu等[32]研究結果顯示,氯曲羅利或唑來膦酸與索拉非尼聯合使用消耗巨噬細胞,通過促進TAM分泌IL-12,能夠增強小鼠嵌合抗原受體T淋巴細胞的抗腫瘤作用,顯著抑制小鼠HCC的進展、腫瘤血管生成和轉移。巨噬細胞的調控也可增強索拉非尼的抗癌活性。索拉非尼在體外通過肝細胞生長因子蛋白-Met信號通路抑制巨噬細胞介導的HCC上皮-間質轉化,同時降低HCC患者的血漿肝細胞生長因子和AFP水平,抑制miR-101的表達,增強雙特異性磷酸酶1的表達,并下調M2細胞中TGFβ的釋放和CD206的表達,從而抑制巨噬細胞介導的HCC生長[33]。

3 HCC中巨噬細胞與鄰近細胞相互作用

3.1 TAM與干細胞、自噬、趨化因子之間的串擾 肝癌干細胞(liver cancer stem cell, LCSC)是具有致瘤性和干細胞樣特征的未分化細胞的微群體,常與癌癥轉移、復發有關。LCSC的激活與TAM分泌的細胞因子密切相關,TAM通過分泌TGF-β1促進干細胞樣特性。研究[34]表明,TAM衍生的IL-6通過STAT3誘導腫瘤干細胞擴增,增強其對炎癥反應的作用,促進HCC的發生。在TAM衍生的外泌體中,發現miR-125a和miR-125b的水平較低并通過靶向CD90來改善干細胞樣特性。來自TAM的TNF-α通過激活Wnt/β-連環蛋白信號通路促進HCC細胞生長。SMMC-7721細胞通過Wnt/β-連環蛋白通路促進M2-TAM衍生的TNF-α機制,在與M2- TAM共培養后具有干細胞樣特性[35]。

在缺氧微環境中,TAM可通過缺氧誘導因子/IL-1β/TLR4通路誘導HCC細胞上皮-間充質轉化。腫瘤細胞的上皮-間質轉化可能由Janus激酶2/STAT3/Snail通路分泌的IL-8觸發,也可被TAM產生的TGF-β1激活[36]。腫瘤細胞中的自噬通過TAM產生的細胞因子或對細胞毒性刺激的抵抗來誘導。自噬缺陷的Kupffer細胞通過增強線粒體活性氧/NF-κB/IL-1α/β信號軸的活性促進炎癥和HCC的發展。SMMC-7721和Huh-7細胞系以及HCC異種移植中的奧沙利鉑細胞毒性可能被TAM激活的腫瘤細胞自噬所抑制[37]。當應用奧沙利鉑治療HCC時,M2-TAM產生更多的IL-17,促進癌細胞的自噬。

CCL15是HCC細胞中表達最豐富的趨化因子之一,可將CCR1細胞招募到HCC的TME中[38]。CCL15-CCR1的活化軸表明CCR1單核細胞和高度轉移的腫瘤細胞可能侵入炎癥微環境中成為HCC治療的靶標。

TAM通過STAT3通路分泌的TNF-α將肝祖細胞轉化為LCSC,TAM產生的各種細胞因子/趨化因子對巨噬細胞有重要影響,通過靶向TAM對干細胞進行干預是一種新的腫瘤免疫治療策略。

3.2 TAM與T淋巴細胞之間的串擾 T淋巴細胞是TME中最重要的免疫細胞,可識別腫瘤相關抗原并在腫瘤破壞中發揮關鍵作用。CD4 T淋巴細胞不僅具有Th的輔助調節功能,還可在體內通過分泌穿孔素和顆粒酶B直接殺死缺乏主要組織相容性復合體Ⅱ類表達的腫瘤細胞。CD4 T淋巴細胞通過同源Th1活性加速M2型到M1型巨噬細胞的復極化,減少腫瘤侵襲。Treg是CD4 T淋巴細胞的亞群,通過抑制抗腫瘤免疫和促進腫瘤進展來增強腫瘤免疫逃逸。Treg可以通過作用于CD8 T淋巴細胞來改變TAM的表型。HCC小鼠模型中的腫瘤源性Treg通過抑制CD8 T淋巴細胞產生IFN-γ和促進TAM轉化為M2型來調節TAM的代謝適應[39]。TAM通過下調Treg的表達對CD8 T淋巴細胞的毒性作用產生抵抗,但仍通過其獨特的抗原特異性細胞毒性殺死TAM。TAM引起癌癥的相關炎癥,導致在HCC的TME中產生炎癥輔助T淋巴細胞亞群,如T濾泡輔助細胞。TLR4誘導單核細胞的激活對于TME肝癌中具有高組織表型CXCR5+-PD-1-BTLA-CD69的濾泡輔助細胞IL-21是必需的,進而誘導漿細胞使癌癥進展。肝臟IgA漿細胞在體外和體內直接抑制細胞毒性T淋巴細胞的激活,誘發細胞衰竭。研究[40]數據表明,IgA復合物刺激的單核細胞/巨噬細胞在HCC的TME中高度表達PD-L1。

TAM可抑制T淋巴細胞的功能狀態。CD4 T淋巴細胞、CD8 T淋巴細胞、Treg構成免疫抑制微環境的重要驅動因素,介導TAM的代謝重塑,并影響巨噬細胞極化的方向以促進腫瘤進展。因此,靶向TAM和T淋巴細胞之間的表面標志物可能是HCC治療中抑制免疫微環境的新機遇。

3.3 TAM和腫瘤相關嗜中性粒細胞(tumor-associated neutrophils, TAN)之間的串擾 TAN可能通過阻礙抗腫瘤免疫來促進腫瘤的進展。中性粒細胞主要通過分泌蛋白酶、產生活性氧、改變血管生成和加速轉移來影響腫瘤的生長。與M1和M2型巨噬細胞類似,中性粒細胞可根據其不同功能分為N1和N2表型。TGF-β的表達使TAN分化為促進腫瘤的N2型細胞,而IFNβ促使TAN轉化為抗腫瘤的N1型細胞。在HCC小鼠模型[41]中,注射TAN和腫瘤細胞的小鼠其腫瘤體積和腫瘤轉移率明顯增加。TAN可以分泌CCL2和CCL17來招募巨噬細胞與Treg,以誘導腫瘤侵襲和血管生成。體外進行的實驗[42]表明TAN可以用同樣的方式招募巨噬細胞。

單核細胞衍生的CXCL2和CXCL8在將中性粒細胞募集到肝癌TME中起到關鍵作用。單核細胞中的糖酵解代謝信號通過6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3/NF-κB通路介導CXCL2和CXCL8的上調[43]。促炎細胞因子IL-17促進TAN向TME募集。CCL2和CCL17是由TAN和外周血中性粒細胞強烈產生的趨化因子,它們強烈地招募巨噬細胞到HCC的TME中。此外,TAN浸潤程度與HCC患者腫瘤侵襲邊緣的血管生成之間存在正相關[44]。

TAN和TAM具有相似之處,通過細胞因子及炎癥通路在腫瘤進展中發揮部分重疊作用,共同促進腫瘤的生長。因此,TAN浸潤是一個不良的預后因素,它會進一步募集TAM,抑制腫瘤對HCC的特異性免疫。

3.4 TAM與癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)之間的串擾 CAF是TME中最豐富的非腫瘤細胞,在腫瘤生長和轉移中發揮著重要作用,影響巨噬細胞招募和向M2表型的極化。在HCC中,CAF被招募并附著在巨噬細胞上,分泌GAS6以促進巨噬細胞M2型極化;向腫瘤小鼠注射人類抗體IgG78,可以特異性地減弱內分泌素對CAF與巨噬細胞相互作用的影響,從而減緩腫瘤的生長[45]。當體外培養時,來自不同腫瘤的CAF會產生大量細胞因子驅動單核細胞分化為M2型巨噬細胞,最具代表性的因子IL-6、GM-CSF已被證實在多種腫瘤疾病中存在,這兩種因子的結合能夠促進TAM的M2極化并影響癌癥患者的預后。細胞外基質是由CAF產生的一組結締物質,由特殊的纖維蛋白組成,與腫瘤轉移的所有步驟有關。作為最重要的基質細胞,CAF決定了細胞外基質的硬度和結構。CAF和TAM之間的相互作用可以促進細胞外基質的重塑及腫瘤的轉移。此外,CAF可以產生CXCL12,誘導TAM分泌血漿蛋白原激活劑抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1),而TAM中PAI-1的上調加速了HCC的惡性進展。Endosialin是C型凝集素樣受體家族的成員,在癌細胞和腫瘤基質細胞中特異性表達。有研究[46]表明,Endosialin主要在CAF中表達,Endosialin陽性的CAF可以通過與TAM中的CD68相互作用招募TAM,并分泌生長停滯特異性蛋白6來介導M2極化,促進HCC的進展。

肝癌TME中,CAF傾向于促進巨噬細胞的M2極化,可能由IL-6的分泌所介導。此外,CAF可生成CXCL12以誘導TAM中PAI-1的分泌,而TAM中PAI-1的上調加速了HCC的惡性進展。HCC中TAM與各鄰近細胞之間相互作用關系如圖2所示。

圖2 在肝癌TME中TAM與鄰近細胞之間的串擾

4 小結與展望

TAM是一種高度異質性的細胞群,是腫瘤進展的關鍵組成部分,成為免疫治療藥物開發的潛在熱點。對于HCC早期患者,巨噬細胞亞型具有抗腫瘤活性,因此TAM的類型和分布應根據HCC分期進一步研究,靶向TAM受體有望成為治療HCC的有效途徑。TAM在腫瘤和其他免疫細胞之間的各種串擾途徑,導致腫瘤更具侵襲性。因此,阻斷HCC細胞與TAM之間的惡性相互作用具有潛在的意義,深入研究巨噬細胞與TME其他成分之間的相互作用是靶向巨噬細胞治療腫瘤的關鍵步驟。然而,巨噬細胞對不同環境細胞因子刺激具有高度的異質性和功能表型多樣性,僅攻擊一個信號軸或TAM受體不足以對癌細胞產生明確的影響。不同的免疫治療手段組合需要進一步了解腫瘤特異性免疫,并在合適的HCC臨床前模型中驗證治療靶點。目前大多數TAM研究僅限于動物模型,小鼠模型與人類在發病機制和對藥物治療的反應方面存在相當大的異質性。為了促進TAM在臨床領域的應用,有必要探索靶向人TAM和肝癌患者免疫微環境的抑制劑。采用代謝組學、蛋白質組學、基因組學、表觀基因組學分析的聯合方法,將有助于揭示HCC特異性免疫治療的新靶點。此外,TME中復雜的細胞相互作用,以及獲得性和先天性免疫系統之間的相互作用,尚未被全面了解,可作為未來研究的重點。綜上,更全面、更深入地了解腫瘤巨噬細胞表型的驅動力和HCC微環境中功能變化的驅動力,將為靶向TAM開發未來的癌癥治療方法提供巨大的幫助。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：蘇會吉負責課題設計,資料分析,撰寫論文;顏耿杰、陳含笑、班少群參與收集數據,修改論文;毛德文、韋艾凌、龍富立負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿。