基于Nrf2信號通路探討茵陳蒿湯對阻塞性黃疸大鼠腎氧化應激損傷的影響及其作用機制

劉軍艦, 陳 帥, 袁紅霞, 許 艷, 張西波, 李忠廉

1 天津市中西醫(yī)結合醫(yī)院肝膽胰外科二, 天津 300100; 2 徐州市中醫(yī)院胸外科, 江蘇 徐州 221003;3 天津中醫(yī)藥大學管理學院, 天津 301617; 4 天津醫(yī)科大學研究生院, 天津 300070

阻塞性黃疸患者通常伴有不同程度的腎損傷,手術打擊可導致并發(fā)急性腎衰竭乃至死亡,因此采取有效措施防治腎衰竭的發(fā)生具有重要意義[1]。阻塞性黃疸引起腎損傷的原因未明,氧化應激損傷可能是導致腎損傷的重要機制[2]。核因子E2相關因子2(NF-E2 related factor 2, Nrf2)是組織和細胞中抗氧化劑減少的關鍵調(diào)節(jié)因子。在正常情況下,Nrf2與細胞質(zhì)中的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)結合,可通過泛素-蛋白酶體途徑快速降解[3]。當身體受到氧化應激刺激時,Nrf2從隔離狀態(tài)釋放并轉移到細胞核,在細胞核中促進抗氧化和細胞保護基因的轉錄。本實驗通過構建阻塞性黃疸大鼠模型,研究茵陳蒿湯對大鼠膽道梗阻時腎損傷的影響與調(diào)節(jié)Nrf2表達及核異位的關系,為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量200～230 g,購買于北京華阜康生物科技股份有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0010;實驗動物使用許可證號:SCXK(津)2020-0008],飼養(yǎng)于天津市中西醫(yī)結合醫(yī)院動物實驗室。大鼠標準飼料喂養(yǎng),飲用水自由,均分籠飼養(yǎng),每籠5只,光照與黑暗各12 h交替處理,濕度為50%～60%,溫度為20～22 ℃,適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實驗藥物和試劑 中藥購于天津市中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥飲片藥房,按照《傷寒論》中茵陳蒿湯劑量組成換算:茵陳120 g,梔子80 g,大黃40 g,共計240 g[4]。中藥浸泡30 min后,煎煮2次,取2次煎煮液濃縮至240 mL,所得茵陳蒿湯含生藥量1 g/mL。血清總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、谷氨酰轉移酶(GGT)、尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號:BC5180、BC5170、BC1550、BC1220、BC1530、BC0170、BC0020);血肌酐(Cr)水平檢測試劑盒購自北京艾普希隆生物科技有限公司(貨號:G1204F);Nrf2、Keap1抗體、蛋白Marker購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(貨號:PA5-27882、PA5-99434、PA5-26617);醌氧化還原酶1(NQO1)抗體購自美國Abcam公司(貨號:ab138491);β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司(貨號:66009-1-Ig);辣根酶標記山羊抗兔/抗小鼠IgG、SP法二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司(貨號:ZB-2301、ZB-2305)。0.45 μm PVDF膜、化學發(fā)光底物ECL試劑盒、RIPA裂解液購自密理博(中國)有限公司(貨號:IPHV00010、WBKLS0500、20-188);蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司(貨號:PC0020、P1041)。

1.1.3 主要設備和儀器 3-30型號K低溫離心機(德國Sigma公司);電泳儀(BIO-RAD公司,PowerPace Basic);酶標儀(上海科華生物工程股份有限公司,ST-360);凝膠成像儀(上海天能科技有限公司,4800Multi);QuantStudio 3型PCR擴增儀(美國ABI公司);T100型熱循環(huán)PCR儀(美國Bio-Rad公司);倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠分組及干預方法 將32只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為假手術組(S組)、模型組(O組)、低劑量茵陳蒿湯組(LY組)、高劑量茵陳蒿湯組(HY組),每組8只。將O組、LY組、HY組大鼠采用膽管雙重結扎的方法建立阻塞性黃疸模型,具體步驟如下:術前12 h禁食水,予面罩吸入異氟烷麻醉,充分消毒大鼠腹部,于上腹正中切口入腹。于膽總管中上1/3行雙重結扎建立阻塞性黃疸模型。S組大鼠僅游離上段膽總管但不予結扎。手術后7天,觀察大鼠小便、皮毛、爪尾顏色變黃,并且出現(xiàn)活動減少、被毛松散、條狀稀便且臭穢等表現(xiàn)后即表明阻塞性黃疸模型建立成功。建模成功后,LY組大鼠每日定時予茵陳蒿湯6.3 mL/kg灌胃,HY組大鼠予茵陳蒿湯18.9 mL/kg灌胃,S組和O組大鼠予6.3 mL/kg蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃7天。采取異氟烷吸入麻醉,下腔靜脈采血,離心后備用;充分顯露腎臟,取部分腎組織置于塑料試管中,編號保存于-80 ℃冰箱中備用,取部分腎組織放入4%多聚甲醛中固定后包埋蠟塊備用。

1.2.2 血清肝、腎功能測定 血液標本靜置30 min,以3 000 r/min離心10 min后取血清,按照試劑盒說明書步驟分別檢測各組大鼠血清TBil、DBil、ALT、GGT、BUN、Cr水平。

1.2.3 檢測大鼠腎組織SOD、MDA水平 取另一部分的腎組織按要求制備腎組織勻漿液,以4 000 r/min離心15 min,分離上清液,按照試劑盒說明書檢測腎組織中SOD、MDA水平。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的水平 采用Prime5.0軟件設計Nrf2、Keap1、NQO1、β-actin基因引物序列(表1),由北京賽百盛基因技術有限公司合成。按照說明書裂解組織,提取總RNA并檢測其濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒對RNA進行逆轉錄,合成擴增前cDNA。以2 μL cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參mRNA,采用SYBR Green依次按照95 ℃預變性2 min,94 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán),檢測基因的表達水平按照2-ΔΔCt法進行定量分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白的表達 液氮研磨-80 ℃下保存的腎組織50 mg,加入裂解液(含蛋白酶抑制劑),置于冰上裂解,18 759×g離心30 min,吸取上清液,測定樣品蛋白濃度,加入SDS-loading buffer,100 ℃金屬浴10 min,每孔上樣20 μg,進行電泳分析,轉膜,封閉,加入Nrf2(1∶500)、Keap1(1∶500)、NQO1(1∶10 000)、β-actin(1∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜;TBST洗膜,加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶8 000)孵育1 h,洗膜,顯色液孵育2 min,成像儀上進行信號檢測,分析條帶。數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白陽性表達情況,比較各組蛋白表達水平。

1.2.6 免疫組化檢測腎組織中Nrf2蛋白的核異位情況 標本常規(guī)石蠟包埋制成5 μm切片,采用免疫組化法進行染色。取3組大鼠腎組織包埋成石蠟組織塊,石蠟切片常規(guī)脫蠟水化;在pH=6的0.01 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,微波大火熱抗原修復15 min;3%過氧化氫溶液封閉15 min;磷酸鹽緩沖液浸洗后Nrf2一抗(1∶100)濕盒中4 ℃過夜進行孵育;二抗(1∶1 000),37 ℃孵育20 min;二氨基聯(lián)苯胺顯色,二次蒸餾水浸洗后蘇木素復染細胞核1 min;梯度酒精分色,二甲苯脫水透明5 min兩次,風干后中性樹脂封片。倒置顯微鏡觀察記錄,選擇各組的陽性和陰性組織相,進行200×的顯微照相。選擇有意義的組織相,按樣本編號保存圖像。并對每張切片隨機選取3個視野,計數(shù)核內(nèi)陽性表達細胞數(shù),結果以陽性表達細胞數(shù)/總細胞數(shù)百分比表示。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中肝、腎功能指標變化比較 與S組比較,O組大鼠血清中TBil、DBil、ALT、GGT、BUN、Cr水平均明顯升高(P值均<0.05);與O組比較,茵陳蒿湯各劑量組上述指標顯著降低(P值均<0.05),且以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.05)(表2)。

2.2 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較 與S組比較,O組大鼠腎組織SOD活性減弱,MDA水平升高(P值均<0.05);與O組比較,茵陳蒿湯各劑量組SOD活性均增強,MDA水平均下降,并以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.05)(表3)。

表2 大鼠血清中TBil、DBil、ALT、GGT、BUN、Cr水平比較

表3 大鼠腎組織SOD、MDA水平比較

2.3 各組大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表達 各組大鼠腎組織中Keap1 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與S組相比,O組大鼠腎組織中Nrf2、NQO1 mRNA的表達均顯著降低(P值均<0.05);茵陳蒿湯各劑量組Nrf2、NQO1 mRNA的表達與O組相比均有不同程度的升高(P值均<0.05),以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.01)(圖1)。

圖1 大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA表達水平比較

expression in renal tissue of rats

2.4 各組大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白的表達 各組大鼠腎組織中Keap1蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與S組比較,O組大鼠腎組織中Nrf2、NQO1蛋白的表達均降低(P值均<0.05);與O組相比,茵陳蒿湯各劑量組Nrf2、NQO1蛋白的表達均有不同程度的升高(P值均<0.05),以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.01)(圖2、3)。

圖2 大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白表達

圖3 大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白表達水平比較

expression in renal tissue of rats

2.5 各組大鼠腎組織中Nrf2蛋白核異位情況 S組大鼠腎小管上皮細胞有少量棕黃色顆粒,整體顏色較淺;O組棕黃色顆粒較S組減少;茵陳蒿湯各劑量組中可見大量棕黃色顆粒,整體顏色較深,且大部分細胞核呈棕黃色(圖4)。與S組比較,O組大鼠腎皮質(zhì)組織中Nrf2細胞核內(nèi)陽性率降低(P<0.05);與O組相比,茵陳蒿湯各劑量組Nrf2細胞核內(nèi)陽性率均顯著升高(P值均<0.01)(圖5)。

圖4 大鼠腎組織中Nrf2蛋白核異位情況(免疫組化染色)

圖5 大鼠腎組織中Nrf2蛋白細胞核陽性率比較

3 討論

阻塞性黃疸是由各種原因引起的細小膽管、肝總管或膽總管機械性梗阻所致,是臨床肝膽外科常見的疾病。它會對全身各個臟器造成不同程度的損傷,腎臟是對由阻塞性黃疸引起的各種損傷中最為敏感的器官之一。急性腎衰竭是阻塞性黃疸患者嚴重的并發(fā)癥之一,其發(fā)生率為6%～8%,病情危險,患者病死率可高達68%[5]。本研究發(fā)現(xiàn),阻塞性黃疸發(fā)生后,大鼠肝、腎功能均呈現(xiàn)不同程度的損傷,這與以往的研究[6]結果一致,提示阻塞性黃疸發(fā)生時,除肝臟以外,腎臟是另一重要的損傷靶器官。有臨床研究[1]表明,阻塞性黃疸患者腎小球濾過率減少或腎功能障礙與血液中脂質(zhì)過氧化和抗氧化狀態(tài)的改變有關,但目前發(fā)生機制仍未完全明確。

茵陳蒿湯是臨床上治療黃疸的中醫(yī)經(jīng)典名方,由茵陳、梔子、大黃組成,主治濕熱黃疸。藥理學研究[7]表明,茵陳其主要活性成分為香豆素類、黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油等成分,發(fā)揮抗菌、抗炎、抗氧化等藥理活性。大黃中主要包含蒽衍生物類、揮發(fā)油類、苷類化合物、有機酸類等成分,這些成分在保護肝腎功能、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能、消炎利膽及促進胰液分泌、抗氧化應激、減輕疼痛、抗腫瘤方面起到重要作用[8]。梔子中主要包括環(huán)烯醚萜類、萜苷類、黃酮類、揮發(fā)油、有機酸酯類、各種微量元素等化學成分。梔子的作用為促進膽汁分泌、抗炎、抗氧化、保護肝功能、促進胰腺分泌、降壓降糖降脂、改善胃功能等[9]。筆者團隊前期研究[10-11]發(fā)現(xiàn),茵陳蒿湯可通過減少線粒體DNA損傷、降低NO產(chǎn)生等途徑減輕阻塞性黃疸大鼠肝臟氧化應激損傷,進而減輕阻塞性黃疸肝損傷,而茵陳蒿湯對阻塞性黃疸腎損傷的作用及機制是另一重要的探索方向。

Nrf2是對抗氧化應激的上游轉錄因子,調(diào)控抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等多種保護性蛋白的轉錄表達[12]。Nrf2是組織和細胞抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者,而Keap1蛋白是一種對Nrf2具有抑制作用的特異負性調(diào)節(jié)蛋白[3]。正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1蛋白偶聯(lián)存在細胞質(zhì)中,并處于穩(wěn)定狀態(tài),可以在泛素-蛋白酶體途徑作用下迅速降解[13]。機體受到刺激發(fā)生氧化應激時,活性氧自由基通過對Keap1進行修飾,導致其構象發(fā)生改變,造成Nrf2與Keap1解偶聯(lián),從而使Nrf2活化[14-15],Nrf2被激活并轉移進入細胞核內(nèi),與小Maf蛋白結合成異二聚體。之后異二聚體與抗氧化反應元件相結合,啟動NQO1、谷胱甘肽、谷胱甘肽-S-轉移酶、血紅素氧化酶等下游抗氧化保護基因及Ⅱ相解毒酶基因的轉錄,這些細胞因子在減輕機體組織氧化應激損傷、調(diào)節(jié)機體解毒代謝方面發(fā)揮了重要作用[16-17]。

本研究發(fā)現(xiàn),阻塞性黃疸大鼠出現(xiàn)肝、腎損傷,腎組織中SOD活性減弱,MDA水平升高,Nrf2、NQO1 mRNA及蛋白表達水平均降低,表明阻塞性黃疸可抑制Nrf2信號通路相關蛋白表達,導致腎臟的抗氧化應激損傷;茵陳蒿湯可以改善阻塞性黃疸大鼠的肝、腎損傷,并增強腎組織中SOD活性,降低MDA水平,提高大鼠腎組織中Nrf2、NQO1 mRNA及蛋白表達水平,而對Keap1表達無明顯影響,提示茵陳蒿湯可能上調(diào)Nrf2蛋白表達,而并非通過調(diào)節(jié)Keap1的表達來啟動下游NQO1基因,發(fā)揮抗氧化應激作用,這與Lu等[18]關于氧化應激損傷的細胞中Nrf2的調(diào)節(jié)作用與Keap1不相關的研究結果一致。另外,Nrf2只能在細胞核中發(fā)揮作用[19],免疫組化結果顯示茵陳蒿湯可明顯促進大鼠腎組織中Nrf2細胞核內(nèi)聚集,表明茵陳蒿湯不僅可以上調(diào)腎組織中Nrf2蛋白的表達,并通過促進Nrf2蛋白核異位來啟動下游抗氧化應激反應相關蛋白的表達。

綜上所述,茵陳蒿湯可以有效減輕阻塞性黃疸引起的腎損傷,其作用機制可能是通過上調(diào)大鼠腎組織中Nrf2蛋白的表達,并促進Nrf2蛋白核異位來介導下游蛋白的表達,調(diào)節(jié)阻塞性黃疸引起的氧化應激反應,進而減少阻塞性黃疸大鼠腎氧化應激損傷。

倫理學聲明：本研究方案于2021年3月經(jīng)由天津市中西醫(yī)結合醫(yī)院(天津市南開醫(yī)院)審批,批號:NKYY-DWLL-2021-102,符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：劉軍艦負責課題設計,資料分析,撰寫論文;陳帥、許艷參與實驗操作及數(shù)據(jù)分析;袁紅霞、張西波參與修改論文;李忠廉負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿。