基于Keap1/Nrf2信號通路探討丹葛解酲湯對酒精性肝病大鼠模型的作用機制

王 銘, 徐建虎,2, 馬 麗,2

1 寧夏醫科大學中醫學院, 銀川 750004; 2 寧夏少數民族醫藥現代化教育部重點實驗室, 銀川 750004

隨著人們生活水平的提高,“酒精濫用”和“酒精依賴”成為普遍現象,酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的發病率也逐年上升,已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。ALD是由于長期大量飲酒導致肝臟代謝障礙的疾病,初期表現為酒精性脂肪肝,繼而向酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌危重癥轉變[2]。據統計,因飲酒導致的肝病占我國肝癌死亡總數的35.5%[3],因此ALD的防治為當前亟待解決的問題。ALD的發病機制復雜多樣[4],其中乙醇在代謝過程中產生的氧化應激反應是導致ALD發生發展的一個主要因素[5]。Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)/核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)信號通路在調節氧化應激反應中發揮著極為重要的作用,可通過調節下游因子的表達,保護機體免受氧化應激損傷[6]。相關研究[7-8]表明,上調Nrf2或促進Nrf2核移位可防治ALD的發生發展。因此,以Keap1/Nrf2信號通路為切入點,將可能成為ALD防治的新靶點。

大多數醫家認為ALD早期應以“濕熱論治”,以健脾化濕、清熱利濕為主要治法[9-12]。本課題組結合多年的臨床經驗認為,單從“濕熱論治”并不完全符合ALD早期的發病機制,“肝氣不疏,氣滯血瘀”“酒毒傷肝,毒損肝絡”強調“瘀血”在ALD的發病中也同樣起著關鍵作用。因此,在“濕熱論治”的基礎上提出“活血調肝”的治法,并以葛花解酲湯為基礎方進行化裁,組方丹葛解酲湯。前期研究[13]表明,丹葛解酲湯可降低丙二醛的含量,升高超氧化物歧化酶水平,對ALD大鼠起到抗氧化的作用,但其對ALD的防治機制尚不能全面揭示。本研究在此基礎上,以Keap1/Nrf2信號通路為視角,觀察其相關蛋白及mRNA的表達水平,進一步闡明丹葛解酲湯干預ALD的分子機制,為其防治ALD提供理論支持及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠96只,雌雄各半,體質量180～220 g,購自寧夏醫科大學動物中心[實驗動物生產許可證號:SCXK(寧)2020-0001;實驗動物使用許可證號:SYXK(寧)2020-0001],所有動物飼養于SPF動物房中。

1.2 藥物 丹葛解酲湯由丹參(15 g)、葛根(15 g)、柴胡(10 g)、黃芩(10 g)、茯苓(10 g)、白術(10 g)、澤瀉(10 g)、陳皮(10 g)、川芎(10 g)、枸杞(5 g)、白芍(5 g)、枳實(5 g)、當歸(5 g)、山楂(5 g)、干姜(5 g)、黨參(5 g)、砂仁(5 g)組成。方中所有藥材均購自寧夏醫科大學附屬回醫中醫院門診部。將上述藥材加10倍水浸泡1 h,大火煮沸后小火煎煮1 h,紗布過濾,收集藥液。再加8倍水煮沸后煎煮1 h,收集藥液。將兩次藥液混合,濃縮至含生藥3 g/mL,冷藏儲存備用。益肝靈片(吉林紫鑫藥業股份有限公司,批號:Z22025133,規格:每片含水飛薊素以水飛薊賓計為21 mg)。56度紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司,批號:SC11511160310087)。

1.3 主要試劑及儀器 蘇木素染色液(珠海貝索生物技術有限公司,批號:BA-4041);伊紅染液(珠海貝索生物技術有限公司,批號:BA-4024);亞細胞結構胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號:AR0106);抗體Keap1(美國Affinity公司,批號:AF5266);Nrf2(美國Affinity公司,批號:AF0639);血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)(美國Affinity公司,批號:AF5393);內參β-actin(美國Affinity公司,批號:AF7018),Lamin B1(美國Affinity公司,批號:AF5161);石蠟切片機(德國萊卡,型號:RM2135);電泳儀(北京六一公司,型號:DYCZ-24DN);核酸蛋白定量儀(美國丹諾爾,型號:DS-11);熒光定量PCR儀(BIO-RAD,型號:CFX ConnectTM)。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 采用計算機隨機數字法將96只SD大鼠隨機分為空白組(n=13)和ALD組(n=83),ALD組參照文獻[14]將56度紅星二鍋頭用純水兌至含40%酒精濃度的白酒,按照10 mL/kg的劑量每日分2次進行灌胃造模(灌胃時間為上午8時和下午4時),連續8周。ALD組大鼠造模過程中死亡15只,8周結束后,存活68只。每組隨機選取3只大鼠,HE染色觀察肝臟病理學變化,以肝臟出現明顯的病理變化為ALD模型復制成功的評估標準。

1.4.2 分組及干預 采用隨機數字法將存活ALD大鼠分為模型組、益肝靈片組、丹葛解酲湯(以下簡稱中藥)低劑量組和中藥高劑量組,每組各17只。其中選用益肝靈片作為陽性對照組,因其主要成分為水飛薊素,具有抗氧化的作用,與本研究中Keap1/Nrf2通路的作用相一致。分別給予益肝靈片藥液(21 mg/kg)和丹葛解酲湯藥液低(6 g/kg)、高(24 g/kg)劑量灌胃(給藥劑量按照成人與大鼠體表面積換算,益肝靈片劑量等于成人等效劑量,中藥高、低劑量分別相當于成人等效劑量的2倍、0.5倍)。空白組和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃,每日1次,連續4周。

1.4.3 樣本收集 實驗12周結束后,各組大鼠禁食不禁水12 h,用1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,心臟采血,血液在室溫靜置一段時間后,3 000 r/min,離心15 min,取上清,于-80 ℃冰箱保存。取血結束后,摘取肝臟,取肝大葉部分組織置于4%多聚甲醛固定液中,其余分裝入凍存管中,液氮速凍,-80 ℃冰箱保存,待檢。

1.4.4 一般情況觀察 實驗過程中觀察各組大鼠精神狀態、活動情況、大小便是否正常、毛色是否光澤。每周測量1次體質量。

1.4.5 HE染色觀察肝臟病理學變化 將肝組織從多聚甲醛中取出,經沖水、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后,制成切片,烤片65 ℃,4.5 h。進行脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木精染色、分化液分化、伊紅染色、透明、封片。光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化并拍照。

1.4.6 Western Blot檢測肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達量 將50 mg肝組織加RIPA裂解液,4 ℃過夜裂解,離心取上清,測定蛋白濃度。另取0.1 g肝組織亞細胞結構胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒提取細胞核蛋白,測定蛋白濃度。根據蛋白定量的結果,加入相應體積的總蛋白樣品與4×上樣緩沖液,95 ℃變性10 min,室溫平衡。將樣品加入配好的凝膠孔中,50V進行SDS-PAGE電泳,后濕轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別在孵育盒中孵育一抗Keap1(1∶1 200)、Nrf2(1∶1 200)、HO-1(1∶1 000),4 ℃反應過夜。孵育二抗,常溫90 min。ECL試劑盒曝光膠片,將膠片掃描后,用Image J軟件測定條帶灰度值。Keap1、HO-1以β-actin為內參,Nrf2以Lamin B1為內參。蛋白表達量=蛋白灰度值/內參灰度值。

1.4.7 實時熒光定量PCR檢測肝臟組織中Keap1、HO-1 mRNA表達水平 用Trizol提取肝組織中總RNA,逆轉錄為cDNA。進行實時熒光定量PCR檢測。將樣品放入實時定量PCR擴增儀中預變性95 ℃ 15 min后,95 ℃變性10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40個循環。用Keap1、HO-1基因引物和β-actin內參基因引物(表1)進行擴增。同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析利用PCR儀繪出擴增曲線,進行結果分析。

表1 引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 實驗過程中,灌胃造模期間由于灌胃手法操作不當以及酒精中毒導致大鼠死亡15只,灌酒后大鼠普遍出現精神萎靡、反應遲緩、嗜睡、毛色發黃等癥狀,個別大鼠出現渾身癱軟、步履蹣跚、眼眶出血及大便稀的癥狀。空白組大鼠精神狀態良好,反應靈敏,食欲大小便均正常。在藥物干預期間,模型組大鼠精神萎靡、行動遲緩、反應遲鈍。與模型組相比,益肝靈片組大鼠精神狀態逐步好轉;中藥低劑量大鼠尿量增多、精神狀態逐步好轉;中藥高劑量組大鼠尿量增多、體質量減輕、精神狀態逐步好轉。

2.2 各組大鼠肝臟病理學變化 空白組大鼠肝細胞排列有序,無炎性細胞浸潤,無壞死,以中心靜脈為中心肝細胞呈放射狀排列;模型組大鼠肝細胞排列紊亂,出現肝細胞壞死,有大量炎性細胞浸潤,并伴有大量的脂滴空泡。與模型組相比,益肝靈片組肝細胞排列整齊,少量炎性細胞浸潤,未見脂滴空泡;中藥低劑量組細胞排列稍變整齊,少量炎性細胞浸潤,偶見脂滴空泡;中藥高劑量組肝組織結構基本正常,肝細胞排列整齊,偶見炎性細胞,未見脂滴空泡(圖1)。

2.3 各組大鼠肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達量 與空白組相比,模型組Keap1蛋白表達量明顯升高(P<0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達量明顯降低(P值均<0.05)。與模型組相比,益肝靈片組、中藥低劑量組和中藥高劑量組Keap1蛋白表達量均降低,Nrf2、HO-1蛋白表達量均升高,差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2,圖2)。

表2 各組大鼠Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達量比較

注:a,空白組;b,模型組;c,益肝靈片組;d,中藥低劑量組;e,中藥高劑量組。

2.4 各組大鼠肝組織中Keap1、HO-1 mRNA表達水平 與空白組相比,模型組Keap1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),HO-1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,益肝靈片組、中藥低劑量組和中藥高劑量組Keap1 mRNA表達水平均降低,HO-1 mRNA表達水平均升高,差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠Keap1、HO-1 mRNA表達水平比較

3 討論

ALD歸屬于中醫“傷酒”“脅痛”“酒癖”“酒疸”“酒臌”等范疇。《諸病源候論·惡酒候》曰:“酒者,水谷之精也,其氣慓悍而有大毒。入于胃則胃脹氣逆,上逆于胸,內蘸于肝膽,故令肝浮膽橫”,指出酒為有毒之邪,易傷及脾胃、肝膽。《血證論·臟腑病機論》曰“木之性主于疏泄,食氣入胃,全賴肝木之氣以疏泄之,則水谷乃化。設肝之清陽不升,不能疏泄水谷,滲瀉中滿之證在所不免”,指出肝的疏泄功能在脾胃運化中起到關鍵作用。同時,肝以血為體,以氣為用。嗜酒過度,導致濕熱酒毒之邪蘊結于體內,損肝傷脾,肝失疏泄則氣滯血瘀,脾失健運則痰濕內生。再者“毒損肝絡”理論的提出,更加突出了“瘀血”在ALD發生發展中的關鍵作用,酒毒傷肝,肝絡受損,肝脈不暢,氣滯血瘀,日久則酒毒、濕熱、瘀血聚積肝絡,進一步加重肝絡損傷。據此,本課題組以理氣健脾、分消酒濕的葛花解酲湯為主方進行化裁,以葛根為君藥,葛根味甘、辛,發散解肌,可疏散酒邪。現代研究[15]表明,葛根的解酒效果優于葛花。山楂消除酒食之積;柴胡、川芎疏肝氣,陳皮、砂仁、枳實行脾胃之氣;澤瀉、茯苓滲濕利水,使酒濕從小便而出;丹參、當歸補血活血;共為臣藥。黨參、白術補中健脾,干姜溫脾化飲;白芍、枸杞柔肝養肝;黃芩清肝膽濕熱;共為佐藥。諸藥合用,共行分消酒濕、理氣健脾、活血調肝之效。

本研究采用酒精攝入方式誘導,即酒精灌胃法建立ALD大鼠模型,通過HE染色顯示模型組大鼠肝細胞排列紊亂,出現肝細胞壞死,有大量炎性細胞浸潤,并伴有大量的脂滴空泡,表明造模成功。通過對大鼠的一般情況、HE染色結果進行觀察,發現丹葛解酲湯可在不同程度上改善大鼠的一般情況及病理變化,且以高劑量組改善效果顯著。

ALD是涉及脂質代謝受損、肝細胞損傷、炎癥反應、抗氧化以及纖維化的慢性疾病[16]。氧化應激被認為是ALD進展的重要促成因素。Nrf2是細胞內抗氧化應激反應的主要調節劑,其有助于控制氧化還原穩態。研究[16]表明Nrf2激活在ALD的細胞保護和脂質代謝中起著至關重要的作用。Keap1是Nrf2最主要的調節蛋白之一,可以對Nrf2進行負調節。在正常情況下,Nrf2與內源性抑制劑Keap1在細胞質中結合,處于非活性狀態,并通過泛化素-蛋白酶途徑迅速降解[17]。在受到氧化應激刺激后,Nrf2與Keap1解體,活化的Nrf2轉入細胞核,與Maf蛋白形成異質二聚體,Nrf2-Maf異質二聚體再與抗氧化反應元件結合,調控下游靶蛋白(如抗氧化蛋白HO-1),發揮抗氧化作用[18]。Keap1/Nrf2信號通路在機體抗氧化應激損傷、維系體內“氧化-抗氧化系統”穩態中發揮著極其重要的作用,且與ALD氧化應激損傷的病理生理密切關聯[19-20]。另外,該信號通路通過加強抗氧化物和解毒酶基因的表達,保護肝細胞免受脂質過氧化的損傷[21]。HO-1是Keap1/Nrf2信號通路下游的靶蛋白,也是強大的細胞保護酶之一,在抗氧化中起著關鍵作用[22]。HO-1可催化血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和鐵離子。膽綠素通過膽綠素還原酶進一步轉化為膽紅素,膽綠素和膽紅素作為內源性活性氧的有效清除劑,可抑制氧化應激反應,減輕肝細胞損傷[23]。越來越多的證據表明Keap1/Nrf2信號通路是治療肝臟疾病的關鍵藥理靶點。本研究發現經丹葛解酲湯干預后,Keap1蛋白表達明顯下調,而Nrf2、HO-1蛋白表達明顯上調,表明該信號通路明顯被激活。結合前期丙二醛含量下降,超氧化物歧化酶水平上升的研究結果[13],提示丹葛解酲湯可抑制Keap1表達,促使Nrf2入核,激活下游HO-1的表達,發揮抗氧化的作用,從而減輕ALD大鼠的肝組織損傷。

綜上所述,丹葛解酲湯可能通過調節Keap1/Nrf2通路,促使Nrf2入核,激活HO-1的表達,減輕氧化應激反應,進而對ALD大鼠起到保護作用。同時也為丹葛解酲湯及活血調肝法應用于臨床提供了科學依據。

倫理學聲明：本研究方案于2022年4月7日經由寧夏醫科大學實驗動物中心實驗動物倫理委員會審批,批號:IACUC-NYLAC-2021-119,符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王銘負責實驗操作,整理數據,撰寫文章;徐建虎負責指導實驗和寫作,分析數據;馬麗負責實驗設計,數據分析,擬定寫作思路,修改文章及定稿。